基于网络药理学联合16S rDNA高通量测序技术分析丹参对感染大肠杆菌小鼠肠道菌群的影响

王 乐，陈泓岑，张永红，吴 琼，侯佳佳，王天祎，卢天航，黄传发，张 华，崔德凤

(北京农学院动物科学技术学院/兽医学(中医药)北京市重点实验室，北京 102206)

随着畜牧业和饲料工业的发展，饲料添加剂的发展进入了一个新的阶段，中草药饲料添加剂以其能预防动物疾病、提高畜禽产品产量和繁殖性能等优点而日益受到关注，应用前景极为广阔。相对于抗生素而言，中草药具有促进动物生长，提高生产性能，改善动物机体免疫，抗氧化、抗炎、抗菌，减少有害气体排放，降低抗性基因蓄积及转移等作用，可作为抗生素替代产品广泛应用于畜禽健康养殖。不论从健康角度还是从经济效益角度来看，替代抗生素产品的生产和研发显得尤为重要，而中草药以其独有的优势成为众多学者的优先选择。因此，开发安全性高的中药饲料添加剂代替原有的抗生素及化学药物将是大势所趋。

丹参又名赤参、紫丹参、红根等，为唇形科植物丹参的干燥根和根状茎。味苦，微寒，归心、肝经，有活血祛瘀、通经止痛、清心除烦、凉血消痈的功效，用于胸痹心痛，脘腹胁痛，癥瘕积聚，热痹疼痛，心烦不眠，月经不调，痛经经闭，疮疡肿痛。据报道，丹参的化学成分主要分为两大类：脂溶性二萜醌类化合物和水溶性酚酸类成分。其中脂溶性包括丹参酮Ⅰ、丹参酮Ⅱ A、丹参酮Ⅱ B、二氢丹参酮、隐丹参酮等，具有抗氧化、消炎、抑菌等作用；而水溶性成分包括丹参素、丹酚酸等，具有抑制血小板凝聚、扩张冠状动脉等作用。李晓明等研究表明，在衣霉素(1 mg·kg) 灌胃复制小鼠急性肝损伤模型中，经丹参酮 Ⅱ 处理后，其可通过抑制肝组织Grp78/caspase-12 通路活化，降低内质网应激水平，改善衣霉素所致的小鼠急性肝损伤。张东涛等用丹参水提物治疗乳鼠心肌细胞缺氧-复氧损伤，发现丹参水提物对缺氧-复氧损伤的心肌细胞具有保护作用，这可能与 PI3K/Akt 信号通路的激活有关。由此可见，丹参对缓解应激具有良好的作用。

然而，目前关于丹参是否对肠道菌群失衡具有调节作用，尚未见报道。因此，本研究以丹参提取物为研究对象，应用网络药理学与高通量测序16S rDNA技术研究丹参对小鼠大肠杆菌感染模型的肠道菌群结构的影响，以期阐明丹参提取物调节菌群结构的作用机制，为丹参提取物的临床应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 丹参活性成分与相应靶点的收集

在TCMSP 数据库(https://tcmspw.com/tcmsp.php)搜索丹参活性成分，根据TCMCP，口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18表示药物成分口服吸收良好并且适合于药物开发，药物对小肠上皮细胞通透性(Caco-2)≥0.4表示药物对小肠上皮细胞通透性良好。因此，根据OB≥30%、DL≥ 0.18、Caco-2≥0.4这3个参数对丹参活性成分进行初步筛选。同时收集活性成分所对应的蛋白靶点，利用 STRING 数据库(https://cn.string-db.org)，转换靶点蛋白为对应的基因名称。

1.2 E. coli靶点基因的获取

在 Genecards数 据 库(https://www.genecards.org/) 中输入关键词“”，查询并收集其靶点基因；将已转换成基因名的丹参活性成分作用靶点与靶点基因取交集(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，从而得到丹参治疗感染的潜在作用靶点。

1.3 丹参治疗E. coli感染的“活性成分-潜在作用靶点”网络构建与分析

将活性成分与对应潜在作用靶点基因导入 Cytoscape 3.8.2软件，构建丹参治疗感染的“活性成分-潜在作用靶点”网络，并应用软件中“Network Analyzer”功能进行网络拓扑结构分析，可获得活性成分及作用靶点的连接度(Degree)、紧密度(Closenesss)及介度(Betweenness)等网络拓扑参数。选取丹参成分连接度≥平均数为关键活性成分，靶点连接度≥平均值为关键靶点。

1.4 丹参成分蛋白互作网络KEGG通路与GO 功能富集分析

利用DAVID 数 据 库(https://david.ncifcrf.gov/)，物种选择“”，对潜在作用靶点进行GO功能分析，利用Metascape数据库(https://metascape.org/)进行 KEGG 通路富集分析，其中GO功能分析包括生物学过程(Biological process，BP)、分子功能(Molecular function，MF)及细胞成分(Cellular component，CC)分析。

1.5 动物分组与处理

本试验以安徽地区精品丹参经煎熬回旋蒸发浓缩后获得的丹参提取药液为研究对象，以110只体重为(20±5)g的昆明小鼠作为试验对象，随机分为5组：对照组(CON)、大肠杆菌感染组()、饲喂低剂量丹参提取物大肠杆菌感染组(EL)、饲喂中剂量丹参提取物大肠杆菌感染组(EM)、饲喂高剂量丹参提取物大肠杆菌感染组(EH)，每组22只。参考人推荐用量的1、5、10倍，设丹参提取物的药物浓度分别为0.0195、0.039、0.078 g·mL，分别为本次试验的低、中、高剂量丹参提取物大肠杆菌感染组给药剂量。小鼠体重以20 g计，按390 mg·kg量进行灌胃，即每次每只试验鼠灌胃0.2 mL。每日定时定量灌胃1次，连续28 d，各丹参组灌胃不同浓度药物0.2 mL，对照组与大肠杆菌感染组均灌胃0.2 mL同等剂量的生理盐水。

1.6 菌种的复苏

将检查过菌种纯度的O菌种进行传代复苏。在灭菌的试管当中进行将该菌种的复苏，将冻存菌液加入到5 mL左右的营养肉汤液体培养基，置于摇床上，转速设定成为220 r·min，温度设定成为37 ℃，培养12 h，传三代复苏至镜下观察菌形态良好即可。将菌液用比浊管比浊，将菌液浓度大概培养至 6×10CFU·mL。

1.7 大肠杆菌的腹腔注射

本试验的5组小鼠连续灌胃28 d后，将新鲜培养所得的O按半数致死量对灌胃低、中、高剂量丹参组和大肠杆菌感染组进行腹腔注射0.2 mL·只，而对照组腹腔注射0.2 mL·只的无菌生理盐水，观察24 h。

1.8 肠道菌群高通量测序

丹参组和大肠杆菌感染组腹腔注射O及对照组注射无菌生理盐水24 h后取小鼠的粪便，进行标记，保存于-80 ℃。使用MagPure Stool DNA KF试剂盒B(Magen，中国)，按照制造商的说明书提取粪便样本的微生物群落DNA。使用Qubit dsDNA BR Assay kit (Invitrogen公司，美国)对DNA进行定量，并用1%琼脂糖凝胶进行均一检测。使用引物341 F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGT-WTCTAAT-3′)扩增细菌16S rRNA基因的可变区V3-V4。正向和反向引物均用Illumina接头、pad和接头序列标记。在含有30 ng模板、融合PCR引物和PCR主混合物的50 μL反应中进行PCR富集。PCR循环条件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30个循环；最后在72 ℃延伸10 min。PCR产物用AmpureXP磁珠纯化，在洗脱缓冲液中洗脱。库通过Agilent 2100生物分析仪(美国Agilent公司)鉴定。使用经过验证的文库在Illumina MiSeq平台(中国深圳BGI)上按照Illumina标准管道进行测序，并产生2×300 bp 的双端读数。

1.9 生物信息学分析

美吉生物一站式科研服务平台(http://www.majorbio.com/)的物种组成分析选项功能中物种Venn图分析，统计多组或多个样本中所共有和独有的物种(如OTU)数目，可以比较直观地展现不同环境样本中物种(如OTU)组成相似性及重叠情况；物种组成分析选项功能中群落组成分析，在不同分类学水平上统计各样本的物种丰度。根据线性判别分析(liner discriminant analysis，LDA)进行LEfSe 多级物种差异判别分析，找出组间在丰度上有显著差异的物种。基因组功能预测与分析应用PICRUSt(PICRUSt流程存储了Greengene ID对应的COG信息和KO信息)对OTU丰度表进行标准化，即去除16S marker gene在物种基因组中的copy数目的影响；然后通过每个OTU 对应的Greengene ID，获得OTU对应的COG家族信息和KEGG Ortholog (KO)信息；并计算各COG的丰度和KO丰度。根据COG数据库的信息，可以从eggNOG数据库中解析到各个COG的描述信息，以及其功能信息，从而得到功能丰度谱；根据KEGG数据库的信息，可以获得KO、Pathway、EC信息，并能根据OTU丰度计算各功能类别的丰度。此外，针对Pathway，运用PICRUSt可获得代谢通路的3个水平信息，并分别得到各个水平的丰度表。

1.10 数据分析

数据采用Excel 2021进行初步处理，采用SPSS 21.0软件ANOVA过程进行单因素方差分析，试验数据用“平均值±标准差”表示，<0.05为差异显著，<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 丹参活性成分及相应靶点

通过TCMSP平台，输入“丹参”搜索。依据设定的OB值、DL值、Caco-2值，从202个化合物中筛选出41个符合条件的化合物(表1)。将符合条件但靶点数为0的化合物，如α-amyrin、sclareol、microstegiol、NSC 122421、tanshinone iia活性成分去除后，最终剩余36个活性成分及669个蛋白质靶点；进入STRING 数据库(https://cn.string-db.org)，选择Multiple protein，Lists of Name输入669个蛋白质靶点，物种选择“Human”，最终转换成对应的基因名。

表1 丹参活性成分Table 1 Active components of Radix Salviae Miltiorrhizae

(续表1 Continued)

2.2 丹参治疗E. coli感染的潜在作用靶点

从Genecards(https://www.genecards.org/)数据库中共获取基因8 902个。同时利用Venny 2.1软件将丹参活性成分的作用靶点与基因靶点取交集，共获得51个潜在作用靶点。

2.3 丹参活性成分蛋白互作网络的构建

将获得的51个交集靶点导入STRING(https://string-db.org/)数据库，通过Cytoscape 3.8.2软件进行蛋白网络结构可视化处理，并将丹参活性成分与潜在作用靶点进行对应，得到活性成分-潜在作用靶点网络(图1)。该网络包含87个节点，457条边，87个节点包括 36个活性成分与51个潜在作用靶点，457条边代表丹参活性成分与潜在作用靶点的相互作用关系，长方形代表丹参活性成分，六边形代表潜在作用靶点。通过 Cytoscape 3.8.2软件的内置“network analyze”插件分析网络的拓扑属性，得到活性成分及潜在作用靶点的介度、紧密度、连接度。经计算，活性成分的连接度平均数为12.69，故选取连接度≥12.69为关键活性成分。关键活性成分作用的靶点个数较多，可能是丹参治疗感染的重要物质基础。因此，选取连接度>10为关键靶点，共有18个靶点符合，分别为PTGS2、SCN5A、ADRB2、OPRM1、CHRM3、NCOA1、PTGS1、ACHE、CA2、RXRA、OPRD1、ADRA1B、CHRM2、NCOA2、SERPIND1、ESR1、AR、DPP4。

图1 丹参治疗E. coli感染的活性成分-潜在作用靶点网络Fig.1 Active components-potential action target network of Radix Salviae Miltiorrhizae response to E. coli infection

2.4 丹参成分蛋白互作网络通路与GO功能富集分析

通过 Metascape数据库(https://metascape.org/)的51个潜在作用靶点进行 KEGG 通路富集分析，得到<0.01的通路82条，选取<0.01，Count≥6通路可视化(图2)。同时，找出18个关键靶点所对应的通路为关键信号通路，共47条。主要包含神经活性配体-受体相互作用、5-羟色胺能突触、雌激素信号通路、钙信号通路、cAMP信号通路、PI3K-Akt信号通路、甲状腺激素信号通路、cGMP-PKG信号通路等途径。

图2 KEGG信号通路富集分析Fig.2 KEGG signaling pathway enrichment analysis

通过 DAVID数据库对丹参治疗感染的51个潜在作用靶点进行 GO 富集分析。以<0.05为筛选条件，获得 BP、MF、CC条目各 174、76、45条。值从小到大排名前10可视化(图3)。结果显示，丹参成分作用的BP主要富集在细胞内类固醇激素受体信号通路、突触囊泡胞吐调节、信号转导、凋亡过程的正调控、对药物的反应、对雌二醇的反应、转录的阳性调节，DNA模板、细胞增殖调节、核糖核酸聚合酶ⅱ启动子转录正调控、血压调节；MF主要富集在RNA聚合酶II转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA结合、酶结合、转录因子结合、蛋白结合、相同蛋白结合、血清素结合、类固醇激素受体活性、高分子复合物结合、蛋白激酶结合、类固醇结合；CC主要富集在神经元投射、突触前膜的组成成分、树突、高分子复合物、细胞质、质膜的整体部件、突触后膜的组成成分、轴突、谷氨酸能突触、质膜。

图3 GO功能富集分析Fig.3 GO function enrichment analysis

2.5 关键成分-关键靶点-关键信号通路网络图

综合网络药理学拓扑参数、KEGG、GO 富集分析所得到的关键成分、关键靶点、关键信号通路，构建丹参治疗“关键成分-关键靶点-关键信号通路”网络(图4)。结果显示，关键成分为丹参“酮、醌”型结构的脂溶性成分。由图4可知，丹参的1种活性成分可对应1个或多个靶标，多种活性成分可对应相同的靶标，提示丹参治疗感染具有多成分、多靶标的特点。

图4 丹参治疗E. coli感染的“关键成分-关键靶点-信号通路”网络Fig.4 Network of “key components-key targets-signaling pathway” of E.coli infection treated with Radix Salviae Miltiorrhizae

2.6 测序数据处理和稀释曲线

2.6.1 测序数据处理 小鼠粪便样本中，剔除低质量序列，最终检出了950 855个有效序列进行后续的分析，去除掉Barcode后，平均长度为460 bp左右。

2.6.2 稀释曲线 按试验数据在各个测序深度下检测到的OTU数目构建稀释曲线。在曲线的起始段，每条曲线的斜率很大，随着测序的增加曲线趋于平缓，显示大部分样品达到稳定状态，说明测序的充分性足够，满足后续分析要求(图5)。

图5 OTU稀释曲线Fig.5 OTU dilution curve

2.7 菌群相似度分析

通过聚类，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，每个小组为一个分类操作单元(OTU)，通常在97%的相似水平下的OTU进行生物信息统计分析。由图6可知，各组之间共有和单独含有的OTUs数量。其中对照组本身含有519个OTUs，大肠杆菌组本身含有174个OTUs，低剂量丹参提取物大肠杆菌感染组本身含有581个OTUs，中剂量丹参提取物大肠杆菌感染组本身含有565个OTUs，高剂量丹参提取物大肠杆菌感染组本身含有698个OTUs，对照组与大肠杆菌组共有的OTUs数量为130个。丹参低剂量大肠杆菌感染组与大肠杆菌感染组共有的OTUs数量为156个，丹参中剂量大肠杆菌感染组与大肠杆菌感染组共有的OTUs数量为135个，丹参高剂量大肠杆菌感染组与大肠杆菌感染组共有的OTUs数量为136个；丹参低剂量大肠杆菌感染组与对照组共有的OTUs数量为409个，丹参中剂量大肠杆菌感染组与对照组共有的OTUs数量为429个，丹参高剂量大肠杆菌感染组与对照组共有的OTUs数量为403个。说明单独感染大肠杆菌减弱了与正常组小鼠菌群的相似度，饲喂低、中、高剂量丹参的大肠杆菌感染组与对照组共有的OTUs数量分别增加了253、294和267个，说明丹参可以提高各组小鼠肠道内菌群的相似度，缓解大肠杆菌对小鼠肠道菌群的损害。

CON. 对照组；E. coli. 大肠杆菌感染组；EL. 低剂量丹参大肠杆菌感染组；EM. 中剂量丹参大肠杆菌感染组；EH. 高剂量丹参大肠杆菌感染组。下同CON. Blank control group; E. coli. E. coli infection group; EL. Low dose Radix Salvia miltiorrhiza infected with E. coli group; EM. Medium dose Radix Salvia miltiorrhiza infected with E. coli group; EH. High dose Radix Salvia miltiorrhiza infected with E. coli group. The same as below图6 五组小鼠粪便的韦恩图分析Fig.6 Venn diagram analysis of feces from five groups of mice

2.8 Alpha多样性分析

Alpha多样性指数中Chao指数和ACE指数反映样品中群落的丰富度，Shannon指数和Simpson指数反映样品中群落的多样性，其中的Chao指数、ACE指数和Shannon指数越大，Simpson指数越小，说明样品中的物种越丰富。本研究发现，与对照组相比，大肠杆菌感染组极显著降低了肠道菌群丰富度(<0.01)，而丹参低、中、高剂量大肠杆菌感染组极显著提高了肠道菌群丰富度(<0.01)，其中丹参高剂量组与其他两个剂量组相比，效果更佳(表2)。与对照组相比，大肠杆菌组肠道菌群多样性显著降低(<0.05)，而丹参低、中、高剂量大肠杆菌感染组与对照组和大肠杆菌感染组相比，则显著增加了肠道菌群多样性(<0.05)。

表2 Alpha多样性结果Table 2 The results of alpha diversity %

2.9 菌群相对丰度变化

2.9.1 门分类学水平上的差异 如表3与图7所示，在门水平上相对排名前三的菌群依次为Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)。与对照组相比，大肠杆菌感染组中的Bacteroidetes极显著减少(<0.01)，Firmicutes丰度显著减少(<0.05)，Proteobacteria丰度极显著增高(<0.01)；与大肠杆菌感染组相比，添加丹参低，中，高剂量大肠杆菌组中的Bacteroidetes丰度极显著增高(<0.01)、Firmicutes丰度显著增高(<0.05)，Proteobacteria丰度极显著降低(<0.01)。说明低、中、高剂量丹参提取物可以缓解大肠杆菌对肠道菌群的破坏，从而维护肠道菌群平衡。

表3 门水平排名前三菌群相对丰度的变化Table 3 Changes in relative abundance of top three microflora at phylum level %

不同颜色的柱子代表不同的物种，柱子的长短代表该物种所占比例的大小。下同The columns of different colors represent different species, and the length of the column represents the proportion of the species. The same as below图7 门水平的样本物种组成分析Fig.7 Analysis of sample species composition at phylum level

2.9.2 属分类学水平上的差异分析 如表4与图8所示，在属水平上相对排名前五的菌群分别为(拟杆菌属)、(螺杆菌属)、(乳杆菌属)、(普氏菌属)和Unclassified(未知菌属)。与对照组相比，大肠杆菌感染组中的、、、丰度极显著降低(<0.01)，Unclassified丰度无显著差异(>0.05)；与大肠杆菌组相比，添加低剂量丹参大肠杆菌组中的、、Unclassified丰度极显著增加(<0.01)，丰度显著增加(<0.05)，丰度无显著差异(>0.05)；添加中剂量丹参大肠杆菌组中的、、丰度极显著增加(<0.01)，、Unclassified丰度无显著差异(>0.05)；添加高剂量丹参大肠杆菌组中的、、Unclassified丰度极显著增加(<0.01)，、丰度显著增加(<0.05)。

表4 属水平排名前五菌群相对丰度的变化Table 4 Changes in relative abundance of top five microflora at genus level %

图8 属水平的样本物种组成分析Fig.8 Analysis of sample species composition at genus level

2.9.3 差异菌群筛选结果 LEfSe分析展示了组间在丰度上有显著差异的物种。从图9可以看出，共发现了14个差异菌群(LDA>4，<0.05)。其中，空白对照组占1种，属水平上有___；大肠杆菌感染组占6种，科水平上有Enterobacteriaceae，属水平上有-、___1，__，，；丹参高剂量大肠杆菌感染组占7种，纲水平上有unclassified_p__Firmicutes，目水平上有unclassified_p__Firmicutes、Lachnospirales，科水平上有unclassified_p__Firmicutes、Lachnospiraceae，属水平上有___、。

图中不同颜色节点表示各级分类水平上的微生物群落，淡黄色节点表示在两个时间点对比均无显著差异的菌群；红色表示两个时间点对比差异显著，且在术前中显著富集的菌群；蓝色表示两个时间点对比差异显著The nodes with different colors indicated the microbial communities at all levels of classification, and the nodes with pale yellow color indicated the microflora with no significant difference compared at two time points. The red color indicated the flora with significant difference in comparison between the two time points and significant enrichment in pre-surgery; Blue indicates significant differences between the two time points图9 LEfSe 分析比较对照组、大肠杆菌感染组、丹参高剂量大肠杆菌感染组差异菌群Fig.9 Differential gut bacterial in control group, E. coli infection group and high-dose Radix Salvia miltiorrhiza infected with E. coli group determined by LEfSe analysis

2.10 功能预测分析

2.10.1 COG 数据库比对结果 基于美吉生物一站式科研服务平台PICRUSt分析平台的功能预测分析将获得的 OTU 丰度表与Greengene 数据库比对，获得相应的 COG 及 KO功能信息及其丰度。分析发现，EL、EM、EH组小鼠肠道菌群功能主要集中于氨基酸、碳水化合物运输与代谢，未知功能，翻译、核糖体结构和生物转化，细胞壁/膜/生物合成等方面，此外还有与能量产生和转换，复制、重组和修复，转录，无机离子运输和代谢等相关的功能基因，随着丹参提取物剂量的增加能够增强这些功能趋势(图10)。

图10 COG功能分类Fig.10 COG functional classification

2.10.2 KEGG 功能预测 根据KEGG数据库中得到的代谢通路Level 2丰度分析结果，各组共有 44 种代谢通路，根据Level 1可以分为6类，其中新陈代谢12种、遗传信息处理4、环境信息处理3种、细胞生理过程4种、人类疾病12种和组织系统9种，去除人类疾病作旭日图。由图11可知，一级代谢通路分别为新陈代谢37.50%、环境信息处理9.38%、遗传信息处理 12.50%、细胞过程 12.50%、组织系统28.13%。二级主要代谢通路有Carbohydrate metabolism-碳水化合物代谢(3.99%)、Amino acid metabolism-氨基酸代谢(3.72%)、Signal transduction-信号转导(7.40%)、Replication and repair-复制和修复(4.41%)、Cell growth and death-细胞生长和死亡(5.56%)、Endocrine system-内分泌系统(9.14%)、Immune system-免疫系统(5.63%)。

图11 KEGG 一级和二级代谢通路Fig.11 KEGG of category level 1 and 2

2.10.3 肠道菌群基因功能预测 通过美吉PICRUt 分析发现，在KEGG L2水平，组与EH组在代谢途径上存在明显差异(图12)。在EH组存在显著差异的功能通路有11个(<0.01)，主要包括肽聚糖生物合成、错配修复、DNA复制、蛋白质输出、同源重组、核糖体、氨酰tRNA生物合成、光合作用、萜类骨架生物合成、赖氨酸生物合成、谷氨酰胺与谷氨酸代谢，在组有2个差异极显著的功能通路(<0.01)，主要包括生物膜形成-铜绿假单胞菌、C5-支链二元酸代谢。

图12 E. coli组与EH组在KEGG L2水平代谢途径差异分析图Fig.12 Analysis chart of metabolic pathway difference between E. coli group and EH group at KEGG L2 level

3 讨 论

肠道菌群数量多、种类庞大而且功能复杂多样，正常的菌群微生态在动物的发育、代谢、免疫、感染的预防及治疗等方面发挥了举足轻重的作用，而这种平衡的关系一旦被打破，则会引起疾病的发生。在过去的生产中，主要使用抗生素来解决肠道菌群失调等问题，其作用机理是杀灭或抑制畜禽体内(特别是消化道内)的有害微生物，调节畜禽胃肠道微生态平衡，从而改善动物机体健康，促进动物生长。然而长期使用抗生素会导致耐药菌产生进而降低药效，使疾病难控，此外抗生素残留在动物性食品中也将危害人类健康。在此环境下，中药以其很少产生耐药性、毒副作用小、且能增强机体免疫功能等特点，具有广阔的应用前景。临床上中药的有效成分与肠道菌群相互作用，大多数药物经肠内菌群吸收代谢后发挥药效。因此，本研究利用网络药理学理论，通过OB、DL 和Caco-2参数来筛选丹参的有效成分，为其在调节肠道菌群平衡中的应用提供理论依据。

本研究发现，通过筛选丹参的36种有效成分的相关靶点，经过生物信息学分析，丹参成分作用的生物学过程主要富集在细胞内类固醇激素受体信号通路、信号转导、凋亡过程的正调控、细胞增殖调节、血压调节等；这与先前的研究结果相一致，丹参具有通经止痛、活血化瘀及凉血消痈等功效，而且还有抗氧化、抗菌消炎、保护心脏、抗肝损伤等作用。可用于临床上肝炎、肿瘤、冠心病等治疗。罗晓梅等研究发现，在脓毒症大鼠模型中，丹参注射液能改善心肌功能，减少心肌细胞凋亡，调节凋亡相关蛋白的表达，上调抗氧化通路，下调炎症通路，进而对脓毒症大鼠心肌损伤起到治疗作用。此外，本研究揭示了丹参有效成分的分子功能富集分析主要在RNA聚合酶II转录因子活性，配体激活的序列特异性DNA结合、血清素结合、类固醇激素受体活性等方面；细胞成分主要富集在神经元投射、突触前膜的组成成分、质膜的整体部件、谷氨酸能突触等方面。值得注意的是，Luo等研究表明，用丹参提取物治疗卵清蛋白(OVA)诱导的过敏性哮喘小鼠，可减少气道炎症细胞浸润、Th1/Th2细胞因子量和杯状细胞增生，减轻OVA致敏哮喘小鼠的气道炎症。Liu等采用丹酚酸B (SAB)治疗实验性肺纤维化，发现SAB通过保护内皮细胞免受氧化应激损伤而在肺纤维化中发挥抗炎作用，减少氧化应激损伤主要通过抑制内皮通透性和通过MAPK和NF-κB信号通路表达促炎细胞因子介导。由此可见，丹参具有抗菌、抗炎和减少机体氧化损伤的作用。此外，本研究通过“成分-靶点-信号通路”网络互作分析结果发现，丹参治疗感染的关键成分为丹参“酮、醌”型结构的脂溶性成分。据报道，从总丹参酮中分离得到丹参酮 Ⅰ、丹参酮 ⅡA、丹参酮 ⅡB、隐丹参酮、羟基丹参酮、丹参酸甲酯；另外还有4个新成分：二氢丹参酮 Ⅰ、丹参新鲲甲、乙、丙，所分离到的化学成分经体外抑菌试验表明，具有二氢呋喃结构的隐丹参酮和二氢丹参酮 Ⅰ有较强的抑菌作用，而其他具有呋喃环结构的成分抑菌作用弱或没有表现出抑菌作用。陈姗姗等研究发现，丹参新酮能抑制 THP-1 细胞的增殖并诱导其凋亡，其机制可能与下调2、1 基因的表达，Bax/Bcl-2 的值增大，激活促凋亡因子caspase-3有关。Wang等研究发现，丹参新酮以剂量依赖的方式下调-、-1b、-6、-8基因的表达，表明丹参新酮对炎症性肠病的抗炎作用可能是通过调TLR4/NF-κB/IQGAP2信号通路实现的。由此可推测，丹参可能通过抑制大肠杆菌所引起的细胞凋亡以及机体的炎症反应而发挥主要作用。本研究的丹参提取物虽然表现出了良好的改善肠道菌群结构和抗大肠杆菌感染的作用，但具体发挥作用的有效成分作用机制还有待进一步的研究。

此外，丹参抗感染的关键靶点KEGG 富集分析表明，cAMP信号通路和PI3K-Akt信号通路具有重要的作用。据报道，环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)是作为哺乳动物体内重要且保守的第二信使之一，可通过转导细胞外信号参与调节多种器官和组织的发育及生理功能。刘阳研究发现，和胃理气方通过激活 cAMP/PKA 信号通路，提高 cAMP和PKA的表达，能够改善肝郁气滞型 FD 模型大鼠的胃肠排空，调节胃肠功能，进而促进胃肠动力。值得注意的是，PI3K/Akt 信号通路由磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)和其下游分子丝氨酸/苏氨酸蛋白激B(PKB/Akt)两部分组成，参与多种生长因子、细胞因子和细胞外基质等的信号转导，同时还参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。本研究采用网络药理学技术得到丹参抗感染的主要通路为cAMP信号通路和PI3K-Akt信号通路，在前人的研究基础上，得知这两条通路可以作用胃肠和调节细胞功能，从而为丹参治疗大肠杆菌感染所致的菌群失调提供了相关理论依据。

本研究OTU聚类分析和Alpha多样性结果表明，感染大肠杆菌的小鼠肠道内菌群的丰富度与均匀度都呈下降趋势，而灌服了低、中、高剂量丹参素提取物之后再感染大肠杆菌的小鼠粪便中，菌群丰富度与均匀度与正常组相似，说明灌服丹参提取物可以提高大肠杆菌感染小鼠肠道中菌群的多样性，其中高剂量丹参提取物组效果最好。此外，通过菌群相似度分析可知，单独感染大肠杆菌减弱了与正常组小鼠菌群的相似度，但饲喂低、中、高剂量丹参组与对照组共有的OTUs数量皆有所增加，说明丹参可以提高小鼠肠道内菌群OTUs数量，缓解大肠杆菌对小鼠肠道菌群的损害性。运用分类学组成，通过不同组分的菌群构成比例绘制柱状图发现，丹参主要影响门水平中的Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)、Proteobacteria(变形菌门)，前两者是健康宿主共有的肠道微生物优势菌群。拟杆菌门和厚壁菌门在大肠杆菌感染组中含量较低，在丹参低、中剂量大肠杆菌感染组依次升高，丹参高剂量大肠杆菌感染组有所降低，但整体为增长趋势，因此丹参可以缓解大肠杆菌对肠道菌群的破坏，使肠道内菌群接近对照组，维护肠道菌群平衡，丹参中剂量组药效最佳。在属水平上，丹参主要影响的是(拟杆菌属)、(螺杆菌属)，拟杆菌属是拟杆菌门中重要的糖化菌，可以产生丰富的糖苷水解酶，将三萜糖苷等转化为极性较小且亲脂性更高的小分子，从而更好地被肠道吸收，说明丹参诱导肠道菌群中拟杆菌属的相对丰度增加有利于小鼠机体更好地维持生理状态。此外，通过COG、KEGG代谢通路对比分析发现，丹参对抗大肠杆菌感染的功能主要集中在氨基酸运输和代谢、碳水化合物转运及代谢上，说明可能含有丰富的蛋白分解、转运及代谢酶相关基因，但具体的作用机制还有待进一步的验证。

4 结 论

本研究基于网络药理学发现，丹参治疗感染作用机制可能是通过18种关键药物活性成分作用于动物机体关键靶点PTGS2、SCN5A、ADRB2、OPRM1、CHRM3、NCOA1、PTGS1、ACHE、CA2、RXRA、OPRD1、ADRA1B、CHRM2、NCOA2、SERPIND1、ESR1、AR、DPP4，影响cAMP信号通路和PI3K-Akt信号通路等。丹参主要通过影响肠道菌群的Bacteroidetes(拟杆菌门)、Firmicutes(厚壁菌门)的丰度来缓解大肠杆菌感染对小鼠肠道菌群的损害作用，调控菌群平衡。