从江香猪睾丸支持细胞分离培养与鉴定

高 艺，黄 泳，冯贤辀，王维勇，徐永健，龚 婷

(1.贵州大学高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室，贵阳 550025；2. 贵州大学 动物科学学院，贵阳 550025)

【研究意义】从江香猪(Congjiang Xiang pigs)是我国珍贵的微型地方猪种，主产于贵州省黔东南州从江县，被列为国家二级珍稀保护畜种。睾丸支持细胞(Sertoli cells，SCs)位于生精小管中，是唯一直接与生精细胞接触的体细胞。支持细胞具有不断改变其功能、细胞骨架、粘附连接以及基因和蛋白质表达以协调精子发生过程的能力，与处在不同时期的生精细胞接触，使生精细胞从最不成熟的精原细胞发育成高度特化的细长精子细胞，最终从生精小管释放成为精子，支持细胞对睾丸的发育和精子的形成至关重要[1-2]。卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone，FSH)和睾酮通过支持细胞的FSH受体和雄激素受体结合蛋白传递激素信号调节精子发生[3]。支持细胞还可分泌雄激素结合蛋白、转铁蛋白、抑制素等调节生精细胞周围微环境的因子[4]，对生精细胞发挥增殖分化、凋亡、吞噬等调节作用[5-7]。睾丸支持细胞的体外分离培养，对于研究哺乳动物雄性生殖机能具有重要意义。【前人研究进展】从江香猪早期生长迅速且性成熟早，公猪30 d时生精小管出现游离精子进入初情期，65～75 d出现爬跨行为，170 d可初配，且其基因纯合，与人类基因相似度优于小鼠、大鼠等常见动物[16-17]，体外培养支持细胞可为从江香猪性早熟机制形成奠定基础。目前，分离支持细胞的方法主要有组织块培养法、酶消化法和机械分离法，酶消化法又分为单一酶消化法、组合酶法等，较常用的方法是组合酶法，常见的消化酶有胶原酶Ⅳ、透明质酸酶、胰酶及DNAseⅠ等[13]。组合酶法相较于单一酶消化法提高了支持细胞成活率和数量，相较于组织块培养法和机械分离法具有简便、节省时间且不易污染的优点[14-15]。不同种属动物睾丸组织结构差别大，在酶和消化时间的选择上仍需探索。【本研究切入点】近年来，国内外学者已在小鼠[8]、大鼠[9]、牛[10]、羊[11]、马[12]等动物和家畜上建立了睾丸支持细胞的分离培养方法，但在猪上特别是地方特色小型猪种上支持细胞的分离培养鉴定仍较少。【拟解决的关键问题】建立从江香猪睾丸支持细胞的体外培养体系，为研究从江香猪支持细胞具体功能提供材料，并促进香猪雄性繁殖特性机制的后续研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试动物 从江香猪睾丸样采集于贵州大学香猪场，2月龄香猪，体况健康，发育良好。香猪进行保定麻醉后，手术法取出两侧睾丸，样品置于含3%双抗的生理盐水中冰上运回实验室。试验香猪按照中国农场动物福利行业标准进行饲养管理。

1.1.2 主要仪器与试剂 正置荧光显微镜(ECLIPSE-Ni+DS-Ri2)购自Nikon公司，PCR扩增仪购自Bio-rad公司，电泳仪购自六一仪器厂，胶原酶Ⅳ型购自Biofroxx公司，青—链霉素(双抗)、磷酸盐缓冲液、胰蛋白酶-EDTA消化液(0.25%)、HE染色试剂盒、5%牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)、4%多聚甲醛和Triton X-100均购自Solarbio公司，胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)、DMEM/F12基础培养基购自Gibco公司，TRIzol RNA抽提试剂、cDNA反转录试剂盒购自Thermo公司，一抗GATA4购自Affinity公司，荧光二抗FITC标记驴抗兔IgG购自Bioss公司，WT1、SOX9、ACTB引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 睾丸组织切片HE染色 从江香猪睾丸组织新鲜样品使用酒精消毒表面，用含3%双抗磷酸盐缓冲盐溶液(Phosphate buffered saline，PBS)清洗干净后，将睾丸组织置于4%多聚甲醛溶液中浸泡4 ℃过夜，经修块、脱水、透明、透蜡、石蜡包埋、切片、展片、烤片等步骤制作睾丸组织石蜡切片，再经脱蜡水化、HE染色、脱水透明、中性树脂封片完成石蜡切片HE染色。

1.2.2 SCs的分离与培养 组织处理：用含3%双抗PBS清洗睾丸样3次后，去除附睾、血管、脂肪等组织，剥离睾丸白膜及睾丸内明显的血管及间质，分离睾丸生精小管后转移到新培养皿中，组织剪碎至无颗粒感后转移到50 mL离心管。酶消化：离心管中加8倍组织体积的0.1%胶原酶Ⅳ，37 ℃震荡孵育50～60 min，1200 r/min离心5 min去上清液，DMEM/F12基础培养基重悬1次去上清液；加3倍体积0.25%胰酶消化10 min，期间滴几滴细胞液到载玻片上镜检，大部分成单细胞时加等体积含10% FBS的DMEM/F12培养基终止消化；为进一步分散细胞团，使用200和400目钢筛过滤，滤液1000 r/min离心5 min弃上清液，加入沉淀2倍体积红细胞裂解液冰浴15 min，充分去除红细胞；1000 r/min离心5 min弃上清液，加含10% FBS的DMEM/F12培养基入瓶置于33 ℃、5% CO2培养箱培养。差速贴壁：原代细胞培养5 h后弃上清液，加入含10% FBS的DMEM/F12培养基扩大培养。

1.2.3 SCs的形态学观察及HE染色 将处于对数生长期的SCs以1×106个/mL接种于铺有细胞爬片的6孔板中，当细胞汇合度达80%～90%时弃去培养基，用PBS清洗3次后，用4%多聚甲醛溶液固定细胞20 min，再用苏木精染色15～20 min，若染色过深则用分色液分色，伊红染色2 min，将细胞爬片取出置于显微镜下观察。

表1 引物序列信息

1.2.4 SCs生长曲线绘制 将培养的原代SCs调整原始浓度为1×104个/mL于24孔板中，每2 d更换细胞培养液，每天进行细胞计数，连续检测8 d。

1.2.5 SCs特异性基因检测 当培养瓶中的细胞汇合度达80%～90%时，弃去培养基PBS，清洗细胞3次，加入Trizol试剂裂解细胞提取总RNA，测定RNA浓度和纯度后使用反转录试剂盒合成cDNA，以cDNA为模板进行RT-PCR。PCR反应体系为：rTaq酶10 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL(10 μmol/L)，ddH2O 7 μL。PCR 反应条件为: 95 ℃ 5 min; 95 ℃ 60 s，59 ℃ 60 s，72 ℃ 1 min，33个循环; 72 ℃ 5 min，用1%琼脂糖凝胶电泳对PCR产物进行鉴定，引物序列见表1。

1.2.6 SCs免疫荧光检测 将处于对数生长期的支持细胞以1×106个/mL接种于铺有细胞爬片的6孔板中，当细胞汇合度达80%时弃去培养基用PBS清洗3次(均在恒速摇床上轻柔清洗，每次5 min)，4% PFA固定细胞20 min，加入0.5% Triton X-100处理20 min，3% BSA封闭30 min，以上步骤均在室温下进行；每张细胞爬片加300 μL GATA-4抗体(1∶200)4 ℃孵育过夜；加入FITC标记的对应种属荧光二抗(1∶300)37 ℃避光孵育2 h；加入终浓度为5 μg/mL DAPI染色1 min，将细胞爬片置于正置荧

光显微镜下拍照观察。

2 结果与分析

2.1 SCs形态学分析

从图1看出，2月龄香猪的睾丸发育正常，睾丸切面清晰可见完整生精小管截面和间质区域。支持细胞位于生精小管生精上皮中，细胞形态不规则，一侧紧贴小管基膜，另一侧延伸至不同发育级别的生精细胞周围，多数细胞染色较生精细胞浅，细胞核形态不规则。生精小管腔面可见整齐排列的生精细胞，小管管腔出现变形精子细胞，小管之间广泛分布间质细胞。

2.2 组合酶消化分离培养SCs

0.1%Ⅳ型胶原酶和0.25%胰酶-EDTA消化后得到大量单细胞混悬液，包括各级生精细胞、支持细胞、睾丸间质细胞、少量细胞团块及组织碎片等(图2)。利用差速贴壁法进行支持细胞纯化后，多数支持细胞5 h贴壁，但仍有生精细胞附着在支持细胞上或悬浮于培养基，此时可换液去除杂细胞(图3)。经分离的SCs贴壁性良好，普通光学显微镜下可见其形态呈梭形或不规则形，每2 d进行细胞换液，培养3 d后SCs呈单层铺满瓶底(图4-A)。此时，细胞生长状态良好，相邻细胞紧密连接，可清晰观察到细胞核及细胞质中的颗粒状物质或小空泡(图4-B)。

2.3 从江香猪睾丸支持细胞HE染色

从图5看出，分离的支持细胞经过HE染色可见其形态不规则，胞质完全铺开，胞体宽大，胞质染色呈淡紫红色；细胞核及卫星小体位于细胞中央或边缘呈不规则形状，染为深紫色。

2.4 从江香猪睾丸支持细胞生长曲线

从图6看出，细胞计数结果显示，从江香猪SCs分离后1～2 d增殖速度缓慢，培养3～6 d细胞增殖速度加快，活性增强，进入对数生长期；培养7～8 d后细胞增长速度下降。整个细胞生长周期呈“S”形曲线，符合一般细胞生长规律。

2.5 SCs 特异性基因鉴定

利用RT-PCR方法检测SCs标志基因，凝胶电泳分析结果(图7)显示，SCs分子标记WT1、SOX9均表达。

2.6 SCs免疫荧光染色

从GATA-4单克隆抗体进行支持细胞免疫荧光鉴定结果(图8)看出，GATA-4特异性染色为绿色，DAPI细胞核染色为蓝色，合并图像显示淡蓝色。经显微镜计数GATA-4抗体免疫阳性率达90%以上。

3 讨 论

支持细胞通过直接接触生精细胞和控制生精小管内环境，促进生精细胞向精子的发展。支持细胞参与胚胎发育时期睾丸索形成，且出生后作为保育细胞影响精子发生中的营养供应、胞间连接以及参与调控生精细胞的有丝分裂和减数分裂[18-20]。支持细胞参与形成的血—睾屏障，通过提供有效的免疫调节，维持睾丸中生精细胞的免疫特权和免疫保护，形成适于精子发生的局部免疫豁免区域，若血—睾屏障结构受损则会发生自身免疫性睾丸炎，导致雄性不育[21-22]。支持细胞也参与其他睾丸体细胞发育和功能的调节，包括支持青春期前睾丸管周肌样细胞和睾丸脉管系统发育以及通过调控类固醇生成影响胎儿和成人睾丸间质细胞的发育和功能从而影响其雄激素分泌水平[23]。

哺乳动物雄性生殖系统的发育分化和精子发生过程中基因表达受多种转录因子的调节，鉴定支持细胞的特异性转录因子选择的SOX9、Wt1、GATA4。Y染色体性别决定区基因盒9(Sex determining region Y，SRY-box 9，SOX9)是胚胎发育和成体阶段多种组织细胞分化所必需的，睾丸发育的整个过程中SOX9 持续表达在支持细胞中[24]，SOX9作为SRY的直接靶点，在哺乳动物的胚胎发育性别决定中起关键作用[25]。在猪上，有研究表明SOX9在支持细胞中呈发育阶段依赖性表达，推测SOX9在早期睾丸发育中起着关键作用[26]。威廉姆斯瘤基因(Wilms tumor suppressor 1，Wt1)是一种抑癌基因，Wt1通过调节支持细胞极性调节精子发生，Wt1敲除会导致生精细胞大量死亡，与人类的非梗阻性无精子症相似[27]。有研究表明Wt1在猪胚胎60 d前主要分布在支持细胞和间质细胞中，而在新生和成年猪睾丸的生精上皮中广泛表达，而在附睾及输精管中未检测到Wt1的表达[28]。GATA 家族蛋白是一组含锌指结构的转录因子，在哺乳动物器官形态发生、细胞增殖和性别分化中起重要作用，GATA 结合蛋白 4(GATA-4)通过调节介导苗勒氏管退化和睾酮产生来促进胎儿男性性腺发育[4]，GATA-4在睾丸发育的整个胎儿期和青春期前期在支持细胞的细胞核中大量表达[29]。

生精小管上皮单细胞悬液制备的关键点在于尽可能去除间质组织和其他杂细胞，在支持细胞分离过程中，可能有管周肌样细胞和间质细胞混杂其中，利用不同细胞贴壁能力的不同，可以采用差速贴壁的方法尽可能去除杂细胞[30-31]，而生精细胞不易贴壁处于悬浮状态，换液即可去除。若仍有少量生精细胞附着于支持细胞上换液不易去除，则可利用生精细胞对低渗液耐受程度较差的特性，使用低渗Tris-HCL溶液使其悬浮后换液继续培养[13]。不同种属不同日龄的动物睾丸内各种细胞数量占比不同，可根据不同的实验需求选择不同日龄的实验动物。笔者前期通过观察从江香猪不同日龄的睾丸组织切片发现生精小管面积随年龄的增长而增加，若无特殊需求应在实验动物的年龄上选择间质组织较少的两月龄以上的香猪[32]。支持细胞鉴定的特异性标记因子并不单一，还可以选择胶质细胞源神经营养因子(Glial cell line-derived neurotrophic factor，GDNF)[33]、雄激素结合蛋白(Androgen binding protein，ABP)[34]等，在特异性抗体的选择上还有WT1[35]、Vimentin[36]等可用于支持细胞的免疫荧光染色检测。

4 结 论

通过使用0.1%胶原酶Ⅳ和0.25%胰蛋白酶-EDTA的两步酶消化法以及差速时间贴壁的方法，分离2月龄香猪睾丸支持细胞，利用此方法获得呈梭形或不规则形，形态大小较均一，细胞汇合后生长连接紧密呈铺路石状的细胞，约3～4 d即可铺满细胞培养瓶底，可进行传代或冻存。对获得的细胞进行鉴定，获得的细胞呈SOX9+/WT1+，GATA-4免疫荧光阳性表达，符合支持细胞的特征。试验成功建立了从江香猪睾丸支持细胞的体外分离培养鉴定方法。