11种食用菌在泡核桃木屑基质中的适应性综合评价

郝振坤， 张文娥， 田风华， 魏 蓉， 付丽蓉， 潘学军(.贵州大学农学院， 贵阳 550025； 2.贵州省果树工程技术研究中心， 贵阳 550025)

我国核桃种植面积和产量均稳居世界第一，随着我国核桃产业的快速发展，核桃产业良种化栽培体系不断完善[1]。核桃林经品种改良产生了大量的核桃木材剩余物，目前处理核桃木材多采用堆放、燃烧等传统利用方式，这不仅导致木屑剩余物中大量的营养物质被浪费，还极易造成环境污染[2]。如何合理有效利用这巨大的生物质资源，实现其资源化利用，成为当前急需解决的重要问题。研究表明，果树修剪废弃枝条中含有大量的木质素、纤维素和半纤维素以及其他有机物质[3]，食用菌可靠自身产生的胞外酶，将这些坚硬、复杂的有机物分解成易被吸收利用的单糖，供菌细胞吸收利用[4]；随着国家对森林资源管控力度的逐步加强，供食用菌生产的木屑价格不断攀升，产业发展与资源短缺的“菌林”矛盾日益突出[5]；若能将核桃木屑用于食用菌栽培，则既能合理利用核桃木屑资源，又能有效缓解菌林矛盾，助力建设美丽乡村。

前人成功利用核桃壳栽培平菇[6]、黑木耳[7]，核桃木屑栽平菇[8]，山核桃外果皮栽培黑木耳[9]及山核桃木屑栽培灵芝[10]，初步证明利用核桃科相关剩余物栽培食用菌具有可行性；但针对贵州省种植广泛的食用菌，尚不明确哪种能较好地分解利用核桃木屑。食用菌在木质纤维素分解过程中产生的胞外漆酶和多酚氧化酶是木质素降解主要酶类，纤维素是纤维素降解的主要酶类，木聚糖酶为半纤维素降解主要酶类，蛋白酶是在底物氮源有限的情况下产生的[11]。研究表明，在一定程度上这些胞外酶活性的强弱可以反映菌丝对基质的生物转化率[12]，因此食用菌对底物营养物质的利用和转化能力可以用其产生的木质纤维素降解酶的活性来表示[13]。本试验选取贵州省栽培广泛的11种木腐型食用菌，测定各食用菌在以核桃木屑为主料的培养基上菌丝生长过程中胞外酶活性及菌丝生长速率，基于隶属函数法对11种食用菌在核桃木屑上生长适应性进行综合评价，通过聚类分析，探寻可有效利用核桃木屑的食用菌种类，为核桃木屑资源化利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

黑木耳、毛木耳、皱木耳、玉木耳、黑皮鸡枞、白玉菇、蟹味菇、滑子菇、香菇、猴头菇、桑黄菌株及杂木屑等栽培原料由贵州大学农学院田风华教授提供，泡核桃木屑由贵州枫核农业发展有限责任公司提供。

表1 供试菌株信息Table 1 Information of tested strains

1.2 试验方法

1.2.1试验设计

试验设硬杂木屑配方(ck)和核桃木屑配方两个处理，每处理5次重复。硬杂木屑为桦木、青冈木等混合木材，取自贵州省纳雍县；泡核桃木屑取自贵州省德江县。以核桃木屑代替基础配方(硬杂木屑78%、麦麸20%、石灰1%、石膏1%)[14]中的硬杂木屑，其他辅料成分占比不变，基质充分混合均匀，控制含水量60%，均匀平铺到直径为9 cm的玻璃培养皿中，121 ℃高压灭菌1 h后冷却至室温，在无菌条件下使用5 mm的打孔器，沿长满菌丝的PDA平板边缘均匀打孔，将菌块接种至培养基中心，24 ℃暗培养，培养第10天测定菌丝生长速率及胞外酶活性[15]。其中香菇和猴头菇培养基中1%的石灰用1%的蔗糖代替。

1.2.2指标测定方法

供试木屑烘干粉碎后，碳含量采用硫酸-重铬酸钾氧化法测定，氮含量采用凯氏定氮法测定，计算木屑碳氮比(C/N)；木质纤维素含量均采用比色法测定；矿质元素含量采用电感耦合等离子体质谱法测定。

采用十字划线法测得各食用菌培养10 d时的菌落直径，菌丝平均生长速率(mm/d)=菌落半径/培养天数[15]。

粗酶液的提取与测定方法：准确称取菌质2 g，适当研磨后移入试管，加去离子水20 mL，37 ℃水浴浸提2 h，四层纱布过滤，将滤液定容至25 mL，4 ℃、8 000 r/min离心10 min，上清液即为粗酶液于-80 ℃保存[16]。多酚氧化酶、蛋白酶、漆酶酶活性的测定参照韩增华等[11]的方法，纤维素酶酶活性的测定参照安琪等[17]的方法，木聚糖酶酶活性的测定参照曹永佳等[18]的方法。

多酚氧化酶酶活力单位：在室温条件下，当pH值为6时，每克样品每分钟吸光度值变化0.001为1个多酚氧化酶活力单位，以U表示[11]。在室温条件下，当pH值为5时，每克样品每分钟吸光度值变化0.1为1个漆酶活力单位，以U表示[11]。木聚糖酶酶活力单位：在37 ℃、pH值为5.50的条件下，每克样品每分钟从浓度为5 mg/mL的木聚糖溶液中降解释放1 μmol还原糖所需要的酶量为1个酶活力单位，以U表示[18]。蛋白酶酶活力单位：在40 ℃、pH值为3.0的条件下，每克样品每分钟水解酪蛋白产生相当于1 μg酚基氨基酸(由酪氨酸等同物表示)的酶量为1个酶活力单位，以U表示[11]。纤维素酶酶活力单位：在37 ℃、pH值为5.5的条件下，每克样品每分钟从浓度为7.5 mg/mL的羧甲基纤维素钠溶液中降解释放1 μmol还原糖所需酶量为1个酶活力单位，以U表示[17]。

注：各处理测定指标的多重比较采用LSD测验，不同小写字母表示 p<0.05 差异显著；图中AA代表黑木耳、AP代表毛木耳、AD代表皱木耳、AC代表玉木耳、HR代表黑皮鸡枞、WHM代表白玉菇、HM代表蟹味菇、PN代表滑子菇、LE代表香菇、HE代表猴头菇、SB代表桑黄。下同。图1 不同基质条件下各食用菌菌丝生长速率Fig.1 The growth rate of mycelium of each edible fungus under different substrate conditions

1.3 数据统计分析

采用Excel软件进行数据统计，SPSS 13.0软件对数据进行方差分析，DPS v 7.05软件进行主成分分析；最终对数据进行隶属函数分析。

隶属函数分析：适应性系数α=处理测定值/对照测定值；对各指标适应性系数进行主成分分析；利用周广生等[19]的公式，U(Xj)=(Xj-Xmin)/(Xmax-Xmin)，求出所有综合指标的隶属函数值；根据综合指标贡献率的大小，求出各综合指标的权重Wj=Pj/∑Pj[20]；根据钮福祥等[21]的公式D=∑(U(Xj)×Wj)，计算综合评价值。聚类分析：对D值进行聚类分析(欧氏距离、最长距离法)，得出11种食用菌在核桃木屑上的生长适应能力强弱。

2 结果与分析

2.1 木屑营养物质含量

由表2可知，核桃木屑和硬杂木屑碳含量及木质纤维素含量均无显著性差异，核桃木屑氮含量显著高于硬杂木屑，核桃木屑(C/N)及纤维素含量低于硬杂木屑，半纤维素及木质素含量均高于硬杂木屑；由表3可知，核桃木屑中P、K、Ca、Mg、Cu含量均显著高于对照，与对照相比分别提高了265.38%、81.16%、55.49%、50.00%、6.25%；而Fe、Zn含量均显著低于对照，与对照相比分别降低了15.24%、51.61%。

表2 木屑营养物质含量Table 2 Nutrient content of sawdust

表3 木屑矿质元素含量Table 3 Mineral element content of sawdust

2.2 泡核桃木屑对各食用菌菌丝生长速率的影响

由图1可知，核桃木屑作为基质主料，显著提高了黑木耳、毛木耳、皱木耳、玉木耳4种木耳属食用菌及桑黄的菌丝平均生长速率；与对照相比分别提高了50.84%、30.29%、32.60%、30.94%和30.23%，对黑木耳菌丝平均生长速率提升幅度最大；白玉菇、蟹味菇、香菇、猴头菇在核桃木屑培养基上菌丝生长速率与对照相比，差异未达到显著水平；黑皮鸡枞、滑子菇在核桃木屑培养基上菌丝生长速率显著低于对照。这表明，核桃木屑作为基质主料，有利于4种木耳属食用菌及多孔菌类桑黄的菌丝生长。

2.3 泡核桃木屑对各食用菌胞外酶活性的影响

由图2可以看出，核桃木屑作为栽培基质主料，显著提高了黑木耳、毛木耳、皱木耳、玉木耳、蟹味菇、滑子菇、香菇、桑黄胞外多酚氧化酶酶活性，比对照分别提高了292.25%、231.44%、100.49%、317.28%、24.07%、53.65%、22.14%、4.87%，核桃木屑对4种木耳属食用菌胞外多酚氧化酶酶活性提升幅度较大。猴头菇在核桃木屑培养基上胞外多酚氧化酶酶活性，与对照相比差异不显著。黑皮鸡枞、白玉菇在核桃木屑培养基上胞外多酚氧化酶酶活性显著低于对照。其中黑皮鸡枞、白玉菇、蟹味菇、香菇、猴头菇、桑黄和4种木耳属食用菌相比，胞外多酚氧化酶酶活性相对较低，多酚氧化酶用于底物中木质素的降解，这表明4种木耳属食用菌对核桃木屑中的木质素利用能力更强。

图2 不同基质条件下各食用菌胞外多酚氧化酶酶活性Fig.2 Extracellular polyphenol oxidase enzyme activity of each edible fungus under different substrate conditions

通过对各食用菌在不同基质条件下胞外漆酶酶活性进行比较，结果表明，猴头菇在核桃木屑培养基上胞外漆酶酶活性与对照无显著性差异，黑皮鸡枞、白玉菇、蟹味菇在核桃木屑培养基上胞外漆酶酶活性显著低于对照。由图3可知，核桃木屑作为主料栽培食用菌，显著提高了黑木耳、毛木耳、皱木耳、玉木耳、滑子菇、香菇、桑黄胞外漆酶酶活性，而且同样对4种木耳属食用菌漆酶酶活性提升幅度较大。漆酶与多酚氧化酶同属于木质素降解酶类，这表明木耳属食用菌对核桃木屑中木质素利用能力较强，白玉菇、蟹味菇、桑黄在核桃木屑培养基和对照培养基上胞外漆酶酶活性均较低，说明其对底物中木质素的分解能力较弱。

图3 不同基质条件下各食用菌胞外漆酶酶活性Fig.3 Extracellular laccase enzyme activity of each edible fungus under different substrate conditions

通过对各食用菌在不同基质条件下胞外木聚糖酶酶活性进行比较，发现绝大多数食用菌在核桃木屑培养基上，胞外木聚糖酶酶活性低于对照；由图4可知，黑木耳、毛木耳、皱木耳、黑皮鸡枞、白玉菇、蟹味菇、香菇、猴头菇、桑黄胞外木聚糖酶酶活性显著低于对照。木聚糖酶用于底物中半纤维素的降解，结合各食用菌在不同基质条件下胞外多酚氧化酶、漆酶酶活性分析，这表明以核桃木屑作为主料，食用菌大多表现为优先利用核桃木屑中丰富的木质素和纤维素，而后分解半纤维素。

图4 不同基质条件下各食用菌胞外木聚糖酶酶活性Fig.4 Extracellular xylanase enzyme activity of each edible fungus under different substrate conditions

由图5可知，核桃木屑作为栽培基质，显著提高了黑木耳、毛木耳、皱木耳、玉木耳、黑皮鸡枞、滑子菇、香菇、猴头菇、桑黄胞外纤维素酶酶活性，对毛木耳、桑黄提升幅度最大，分别为338.86%、244.62%；蟹味菇在核桃木屑培养基上胞外纤维素酶酶活性高于对照，但差异不显著；白玉菇在核桃木屑培养基上胞外纤维素酶酶活性显著低于对照。这表明，核桃木屑可提高绝大多数食用菌胞外纤维素酶酶活性，提高对底物中纤维素的分解能力。

图5 不同基质条件下各食用菌胞外纤维素酶酶活性Fig.5 Extracellular cellulase enzyme activity of each edible fungus under different substrate conditions

对各食用菌在不同基质条件下胞外蛋白酶酶活性进行比较，结果(图6)表明，除香菇外的10种食用菌在核桃木屑培养基上胞外蛋白酶酶活性显著高于对照，核桃木屑培养基对白玉菇蛋白酶酶活性提升幅度最大，达到了60%。蛋白酶是在底物氮源不足的情况下产生的，绝大多数食用菌在核桃木屑培养基上蛋白酶活性高于对照，说明以核桃木屑为主料的培养基中的氮源，不能满足大多数食用菌的生长。

图6 不同基质条件下各食用菌胞外蛋白酶酶活性Fig.6 Extracellular protease enzyme activity of each edible fungus under different substrate conditions

2.4 单项指标的适应性系数及其相关性分析

由表4可以看出，不同食用菌种类相同指标或同种食用菌不同指标，其适应性系数均不相同，有的表现为上升(α>100%)，有的则表现为下降(α<100%)。因此，以不同单项指标的适应性系数评价食用菌在核桃木屑培养基上的生长适应性，所得结果也不相同。这表明，食用菌在不同基质上的生长适应性是一个综合性状，用某一单项指标评价其生长适应性存在片面性，相同条件下单一指标表征不同种食用菌在底物上的生长适应性存在差异，不能得出较为科学的结果。

表4 各单项指标的适应性系数Table 4 Adaptability coefficient of each individual index

从表5可以看出，菌丝生长速率与多酚氧化酶、漆酶酶活性均呈极显著正相关，漆酶与多酚氧化酶酶活性之间同样呈极显著正相关性；而蛋白酶与其余各指标均呈负相关性，但均未达到显著水平。

表5 各单项指标适应性系数的相关性分析Table 5 Correlation analysis on the adaptability coefficient of each individual index

2.5 各单项指标的适应性系数的主成分分析

对6个单项指标的适应性系数进行主成分分析，由表6可知，前3个综合指标(Z 1、Z 2、Z 3)的贡献率分别为54.511%、19.300%和12.934%，累计贡献率达86.745%，这表明，前3个综合指标代表了原有6个指标86.745%的信息，可分别用这3个主成分对各食用菌在核桃木屑培养基上的生长适应性进行概括分析；3个主成分的特征值分别为3.271、1.158和0.776，第一主成分贡献率最大。

表6 各主成分的特征值及贡献率Table 6 Eigenvalue and contribution rate of each principal component

根据表7，得出各主成分对应的特征向量表达式分别为：

表7 各主成分特征向量Table 7 Eigenvectors of principal components

第一主成分Z1=0.471 5X1+0.486 6X2+0.519 3X3+0.174 0X4+0.345 6X5-0.348 6X6

第二主成分Z2=0.363 2X1-0.046 1X2+0.167 2X3-0.833 5X4+0.104 7X5+0.363 8X6

第三主成分Z3=0.194 0X1+0.505 4X2+0.048 1X3+0.192 0X4-0.662 3X5+0.478 6X6

其中，X1为菌丝生长平均速率、X2为多酚氧化酶酶活性、X3为漆酶酶活性、X4为木聚糖酶酶活性、X5为纤维素酶酶活性、X6为蛋白酶酶活性。

单项指标的载荷系数反映了各单项指标对综合指标影响的大小，正负代表变化方向的差别，绝对值越大表明该单项指标对主成分影响越大，正号表示对主成分正向影响，负号表示对主成分负向影响。第一主成分Z 1中菌丝平均生长速率、多酚氧化酶酶活性和漆酶酶活性系数较大，表明Z 1受这3个指标影响较大；第二主成分Z 2中木聚糖酶酶活性系数为负数且绝对值较大，表明木聚糖酶酶活性对Z 2起负向影响；Z 3中多酚氧化酶、纤维素酶和蛋白酶酶活性系数绝对值均较大，表明Z 3受这3种酶酶活性影响较大。

2.6 综合分析

以所有综合指标的数值为原始依据进行隶属函数分析，所得隶属函数值D值见表8。根据综合评价值，通过聚类分析在距离0.33处将11种食用菌分为4类(图7)，其中黑木耳、毛木耳聚为一类，在核桃木屑培养基上表现出较强的生长适应性，其综合评价值分别为0.887、0.882；玉木耳、皱木耳适应性中等，D值分别为0.606、0.514；滑子菇、猴头菇、桑黄、香菇适应性较弱，D值分别为0.255、0.263、0.416、0.300；黑皮鸡枞、白玉菇、蟹味菇在核桃木屑上生长适应性较差，D值分别为0.074、0.187、0.181。

表8 各种食用菌的综合指标值、隶属函数值及D值Table 8 Comprehensive index value, membership function value and D value of various edible fungi

图7 各种食用菌综合评价值系统聚类分析Fig.7 Systematic cluster analysis of comprehensive evaluation value of various edible fungi

3 讨 论

食用菌可从栽培基质中获取碳、氮、矿质元素等营养物质，基质碳氮比是影响食用菌生长和产量的重要因素之一。研究发现，不同碳源和氮源物质会影响食用菌对培养料的分解，而过量的碳和氮会抑制食用菌菌丝生长；食用菌种类不同，其菌丝生长速率和对基质底物的分解能力有较大差异[22]。生长速度是食用菌生长特性的重要指标，也是食用菌生产中栽培基质筛选的重要依据[23]；菌株间胞外酶活性差异则表征食用菌分解基质中营养物质的速度和能力，也可作为食用菌栽培种类筛选的重要生理生化指标，为快速准确鉴别菌株的生产性能提供理论依据[24]。

食用菌胞外酶能将木质纤维素等生物大分子物质分解转变成能被吸收的单糖，供菌细胞吸收利用[4]。漆酶和多酚氧化酶是食用菌分解利用木质素等大分子物质的主要酚氧化酶，是一种含铜的糖蛋白，在木质素降解中起重要作用[25]，在栽培基质中添加Cu2+可显著提高漆酶活性[18]；本研究发现，核桃木屑中Cu含量明显高于硬杂木屑的，在核桃木屑培养基中7种食用菌(黑木耳、毛木耳、皱木耳、玉木耳、滑子菇、香菇、桑黄)的胞外漆酶和多酚氧化酶酶活性显著高于硬杂木屑，这可能与核桃木屑中Cu含量较高有关。Milica等[26]发现，黑木耳具有成熟的酶系统和对木质素降解的高选择性，本试验中在核桃木屑基质黑木耳多酚氧化酶酶活性提高292%、漆酶酶活性提高232%，同样表明黑木耳对核桃木屑木质素具有较强的降解能力。此外，研究发现食用菌胞外漆酶、多酚氧化酶酶活性呈显著正相关，这与韩增华等[11]的结论一致。在基质中木聚糖酶负责半纤维素的降解，本研究中核桃木屑基质中的10种食用菌胞外木聚糖酶酶活性显著低于对照(玉木耳除外)，这表明绝大多数食用菌会优先利用基质中的木质素和纤维素，同时减弱对半纤维素的利用能力，与方宏阳等[27]的结论相符。尹淑丽等[28]研究发现，核桃剪枝木屑是一种优良的碳氮源，可为香菇生长提供充足的养分促进菌丝的生长；本研究发现香菇在核桃木屑基质上菌丝更浓密，有效促进了香菇菌丝生物量。

本研究发现不同食用菌对木质纤维素的降解规律不同，用单一指标难以准确评价食用菌在核桃木屑中的生长适应性。模糊数学法在植物抗性综合评价中已被广泛应用，可对多个性状进行综合分析[29-30]；本研究先利用主成分分析法将11种食用菌的6个独立的生理指标转化成3个综合指标，然后根据综合指标值进行相应的隶属函数加权计算得到综合评价值，D值能客观地反映了11种食用菌在核桃木屑上的生长适应性。最后根据D值利用系统聚类分析法将11种食用菌在核桃木屑上的生长适应性分为4类。综合评价结果表明4种木耳属食用菌能有效降解利用核桃木屑中的木质纤维素，在核桃木屑上菌丝生长速率较快，为生长适应性较强的类型；而黑皮鸡枞、白玉菇和蟹味菇在核桃木屑基质上木质纤维素降解能力较差、生长较慢，聚类为生长适应性最差的一类，这与本试验的观察结果和其他研究者的研究结果一致，本试验结果表明，综合评价方法可以克服单一指标的缺点，全面准确地评价食用菌在基质栽培中的生长适应性。

综上可见，木耳属食用菌在核桃木屑基质中表现出较强的生长适应性，利用核桃木废弃物栽培食用菌是实现废弃物资源循环利用行之有效的方法；本试验不仅为核桃木屑“菌质化”利用提供了菌种选择依据，同时为农林废弃物适生食用菌筛选提供了一种科学的评价方法。徐彦军等[31]发现，添加45%茶枝屑会抑制香菇菌丝的生长，可能与茶枝屑中多酚物质增多有关；而核桃木中多酚类物质含量同样丰富[32]，该特性能否提高适生菌种类(如木耳属食用菌)的内在品质，黑皮鸡枞、白玉菇和蟹味菇等食用菌种类在核桃木屑基质中生长不良的原因是否也与其相关，这些问题有待进一步探讨。