GmRACK1参与H2O2和ABA对大豆种子萌发的调节机理研究

郭君洁， 王春弘， 仲 杰， 李鸿雁(黄淮学院生物与食品工程学院， 河南 驻马店 463000)

种子萌发是一个复杂的过程，受到内源信号和外部环境的综合影响。由于种子萌发是植物生命周期中的一个关键阶段，是植物生长发育的第一步，因此，了解种子萌发的生理和分子机制，以便对其进行遗传调控具有重要意义。在过去几十年中，已经进行了大量的研究来探索种子萌发机制[1]。植物激素和许多信号分子(如ROS、NO等)在种子发育和种子吸胀过程中会发生剧烈变化，响应生长发育[2]。脱落酸(ABA)和赤霉素(GAs)被认为是控制种子休眠和萌发的两种主要激素[3]。ABA促进种子休眠，而GA则是种子萌发开始和完成所必需的。一般认为，种子萌发是由ABA和GA之间的拮抗作用调节的。然而，ABA和GA对种子萌发的调节比想象的要复杂得多。Okamoto等[4]发现，尽管外源ABA的应用抑制了发芽，但外源ABA与内源ABA对ABA介导的基因转录的影响不同。外源ABA对几个ABA相关基因在吸胀后期的表达影响显著，而内源ABA影响关键成分的表达，例如ABA信号、光合作用、生理和代谢基因，包括GA生物合成酶。

尽管活性氧长期以来被认为是有害分子，但它们作为细胞信号分子逐渐被证实，并在植物中得到了广泛的研究[5]。在种子发育和萌发过程中，活性氧水平会发生很大的变化。越来越多的研究表明，活性氧可能在种子萌发期间作为信号分子，并积极控制种子萌发[6]。然而，目前对活性氧在种子萌发过程中的信号通路研究报道较少。

活化C激酶1受体(RACK 1)是最重要的WD(色氨酸-天冬氨酸)重复序列，在所有真核生物中都有发现[7]。作为支架蛋白，RACK 1参与多种信号通路[8]。第一个植物RACK 1被鉴定为烟草BY-2悬浮细胞中的生长素诱导基因arcA[9]，此后，RACK1基因从一系列植物物种中分离，包括拟南芥、水稻等，并发现RACK1在不同组织和器官中广泛表达，包括叶、茎、根和花等[10]，这意味着RACK1可能在植物生长发育中发挥重要作用。Chen等[11]发现，rack1a突变体对几种植物激素的敏感性明显不同，例如种子萌发时对赤霉素和油菜素类固醇的敏感性降低；不定根和侧根形成时对生长素的敏感性降低；以及种子萌发和幼苗早期发育时对ABA的敏感性升高[11]。Islas Flores等[12]使用RNAi方法抑制菜豆RACK1基因表达(PvRACK1)，并发现PvRACK1在根中的mRNA积累是由生长素、ABA、细胞分裂素和赤霉素诱导的。

对拟南芥和水稻RACK1在干旱胁迫响应中的功能的研究表明，当RACK1基因表达受抑制时，叶片ABA水平显著增加，从而提高了幼苗对土壤干旱的耐受性[13]。越来越多的研究表明，RACK1对植物发育起关键作用，如拟南芥RACK1A中的功能缺失突变会导致多种发育过程中的缺陷，包括种子萌发、叶片生产和开花[11]。以拟南芥RACK 1 A蛋白(NCBI登录号：NP_173248)为模板的BLASTP搜索显示，在大豆基因组中，有1个RACK1同源基因GmRACK1(Q 39836)，在氨基酸水平上与拟南芥RACK 1蛋白约92.2%相似。然而，目前对RACK1是否参与以及它如何调节种子萌发的机理鲜见报道。在本实验中，选择大豆作为实验材料，首先构建了一系列GmRACK1基因过表达或抑制表达的转基因大豆株系，并探讨了GmRACK1在调节种子萌发中的作用。

1 材料和方法

1.1 植物材料

大豆(Glycinemax(L.) Merr.)“中黄13”被用作野生型(非转基因系，WT)并用于所有转基因植株的产生。所有转基因大豆株系均由本实验室获得并保存。本研究以GmRACK1第5代过表达转基因株系Oe1 2、Oe 27和RNAi抑制表达转基因株系Ri 9、Ri 22为实验材料[14]。

1.2 植物生长条件、种子发芽试验和胁迫处理

用70%(v/v)的酒精清洗大豆种子30 s，然后用无菌水清洗3次。随后将灭菌种子种植在铺有无菌滤纸的培养皿(直径150 mm)中。分别用不同浓度的ABA(0.40 mmol/L)、氟啶酮(20 mmol/L)、烯唑醇(100 mmol/L)或H2O2(20 mmol/L，Sigma)。ABA(混合异构体，Sigma)、氟啶酮(Sigma)和烯唑醇(Sigma)用乙醇溶解。对照培养皿中含有等量的无菌水。种子在培养室中萌发，光照12 h/黑暗12 h，温度28 ℃。在指定时间记录发芽情况。每个基因型使用50粒种子，并进行3次重复。计算3次试验的平均发芽率±se(标准误差)。收集在水或ABA存在下不同时间吸胀的种子，并在-80 ℃下储存，用于ABA和H2O2测定和基因表达分析。

1.3 基因表达分析

qPCR按SYBR Premix Ex TaqTM 试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)说明书提供的试验步骤进行。使用7 500实时PCR系统(ABI)测量每个基因的转录水平。Actin 2 (V 00450)作为对照。每个实验进行3次生物重复。qRT PCR的引物序列如表1所示。

表1 引物名称及序列Table 1 Primers name and its sequences

1.4 蛋白质印迹分析

将大豆种子或叶片在含有蛋白酶抑制剂的TEDM缓冲液(20 mmol/L Tris/HCl，pH值为7.5，1 mmol/L DTT，5 mmol/L EDTA和10 mmol/L MgCl2)中均浆。匀浆在4 ℃以下6 000 g离心30 min以去除细胞碎片，上清液在4 ℃下以5 000 g离心90 min以澄清。可溶性蛋白质在10%凝胶上通过SDS-PAGE分离，并在Hybond-P膜(美国/GE)上印迹，以Actin作为对照。本实验所用抗体购自北京百奥创新科技有限公司。

1.5 内源ABA和H2O2水平的定量分析

对吸水种子的内源ABA水平进行了测量。简单地说，将10粒吸水的大豆种子在5 mL蒸馏水中均质化，然后在4 ℃下摇动一夜。匀浆在4 ℃下以12 000 g离心10 min，上清液直接用于ABA测定。如Quarrie等[15]所述，使用放射免疫分析法(RIA)进行ABA分析。

为了测量吸收种子的内源性H2O2水平，将10粒种子在500 mL磷酸盐缓冲液(20 mmol/L K2HPO4，pH值6.5)中均浆。离心后，将50 mL上清液与0.2 U/mL辣根过氧化物酶和100 mmol/L ADHP(10-乙酰基-3,7-二羟基吩嗪)在黑暗中培养30 min。使用EpochTM微孔板阅读器(BioTek)对荧光进行定量(激发波长为560 nm，发射波长为590 nm)。

1.6 统计分析

数据方差分析和多重比较(Duncan多范围检验；p<0.05显著性水平)使用SPSS 17.0软件。显著差异在图中标记为“*”。

2 结果与分析

2.1 转基因株系鉴定分析

为了研究GmRACK1在种子萌发和幼苗生长中的功能，首先培育了一系列转基因大豆株系，其中GmRACK1基因的表达通过RNA干扰下调，或通过Ubi启动子过表达上调[14]。图1显示了GmRACK1在对照及转基因株系吸水后种子中的表达。通过qPCR测定，与野生型相比，过表达转基因株系(OEs)中GmRACK1的转录水平高出45.04%和50.61%，而RNAi转基因株系(Ris)中GmRACK1的转录水平低30.91%和36.66%(图1 A)。使用GmRACK1特异性抗体的western blot分析表明，RACK 1蛋白在OEs上调，而在Ris下调(图1 B)。

2.2 不同转基因大豆种子萌发及其对ABA和H2O2的响应

种子萌发是一个多阶段的过程，涉及复杂的调控网络。为了评估GmRACK1在大豆发芽中的作用，在标准发芽条件下选择了不同转基因大豆株系的种子，并测定发芽动力学。吸胀36 h后种子开始萌发，WT的发芽率迅速提高，但Ris种子的发芽显著延迟，随着时间的延长，发芽率缓慢增加(图2 A)。ABA处理后，所有大豆基因型的种子萌发显著延缓。然而，Ris种子的萌发对外源ABA的处理比WT和OEs更敏感(图2 B)。这些结果表明，WT和GmRACK1过表达大豆种子萌发速率显著高于Ri种子萌发速率且外源ABA对所有基因型的种子萌发均有抑制作用。为了探索内源ABA在控制种子萌发中的作用，用ABA生物合成抑制剂氟啶酮(Fluridone，Flu)和ABA分解代谢抑制剂烯唑醇(Diniconazole, Din)进行处理，并测定了种子萌发动力学。如图2 C至图2 E所示，与对照处理相比，氟啶酮处理对所有基因型的种子萌发均无明显影响(图2 C)。当用氟啶酮与外源ABA联合处理和单独用ABA处理种子时，其发芽率也出现相似的结果。这说明Ris抑制种子萌发不是影响ABA合成。然而，烯唑醇处理显著延迟了所有基因型的种子萌发，尤其是在种子萌发早期，即吸胀后48 h内。在Ris系中观察到更严重的发芽延迟(图2 E)。这说明RACK1可能通过影响ABA代谢来调节种子萌发。

注：“*”表示转基因系的种子萌发与野生型相比存在显著差异(p<0.05)。下同。图2 不同处理对不同转基因系种子萌发的影响Fig.2 Effects of different treatments on seed germination of different transgenic lines

本试验还研究了Ris对ABA抑制发芽的敏感性是否与ABA浓度相关(图3)，当ABA浓度越高，对种子萌发延缓越显著。总之，这些结果表明，延迟种子发芽可能的因素是RACK 1抑制ABA分解代谢而不是促进ABA生物合成，GmRACK1可能通过控制ABA代谢发挥其作用。

众所周知，ABA处理以及不利的环境因素能诱导H2O2的产生，H2O2也可能参与调节种子萌发[15]。然而，目前还不清楚H2O2调节种子萌发的分子机制。在本研究中，评估了外源H2O2处理对不同转基因大豆株系种子萌发的影响。结果表明，外源H2O2处理显著刺激了所有基因型的种子萌发，吸胀48 h后，WT和OEs的发芽率约为67%，Ris的发芽率约为48%(图2 F)，而用水处理，WT和OEs的发芽率约为40%，Ris的发芽率约为15%，Ris对H2O2促进种子萌发更为敏感。这些结果表明H2O2也可能参与GmRACK1对种子萌发的调节。

注：A为在不同浓度的ABA(0、5、10和20 μmol/L)处理48 h后种子萌发的形态。B为在0、5、10和20 μmol/L ABA处理下48 h的种子发芽率。图3 不同浓度的ABA处理对不同转基因系种子萌发的影响Fig.3 Effects of different concentration of ABA treatments on seed germination of different transgenic lines

2.3 ABA和H2O2相互作用对不同转基因大豆种子萌发的影响

如上所述，ABA对种子萌发有抑制作用，而H2O2对种子萌发有刺激作用，ABA在许多过程中与H2O2相互作用。然而，目前尚不清楚ABA如何与H2O2相互作用来调节种子萌发，以及它们在GmRACK1介导种子萌发中的作用。本研究比较了单独或同时用ABA或H2O2处理不同GmRACK1转基因大豆系的种子发芽情况。如图4所示，ABA显著抑制种子萌发，而H2O2刺激种子萌发。然而，对于WT和OEs，H2O2几乎完全消除ABA对种子萌发的抑制作用，对于Ris株系，它显著减轻ABA对种子萌发的抑制作用。进一步分析了不同转基因大豆株系的H2O2水平以及不同浓度ABA对吸胀种子产生H2O2的量进行测定。在不同转基因大豆株系的吸胀种子中检测到H2O2水平的巨大差异(图5 A)。与WT相比，OEs的H2O2水平显著升高，而Ris的H2O2水平显著降低，这可能部分解释了不同转基因大豆株系之间萌发模式的差异。从图5 B可以看出，ABA浓度与H2O2的浓度成反比。如图6所示，随着吸胀时间的延长，内源ABA水平显著降低，不同转基因大豆株系之间的ABA水平存在显著差异。Ris株系的吸水种子中ABA水平显著高于WT和OEs，这至少可以部分解释Ris种子萌发缓慢和延迟是因为其内源ABA含量较高引起的。

图4 外源ABA和H2O2对不同转基因系种子萌发的影响Fig.4 Effects of exogenous ABA and H2O2 on seed germination of different transgenic lines

图5 不同转基因大豆株系之间H2O2相对含量的比较以及不同浓度ABA处理对吸胀种子中H2O2含量的影响Fig.5 Comparison of relative H2O2 contents among different transgenic soybean lines and the effect of ABA treatment on it in imbibed seeds

图6 不同转基因株系吸胀种子内源ABA含量的比较Fig.6 Comparison of endogenous ABA contents in imbibed seeds of different transgenic lines

3 讨 论

3.1 GmRACK1下调抑制萌发可能与ABA有关

RACK 1是一种高度保守的支架蛋白，在植物组织中广泛表达。RACK 1参与多种信号通路，包括生长发育和对外部环境的响应[11]。然而，与哺乳动物RACK 1的研究进展相比，植物RACK 1的功能和分子机制的研究还处于起步阶段。本课题组和其他几个研究团队研究了RACK 1在植物生长发育和对环境响应中的作用，发现RACK 1参与调节细胞增殖和伸长、种子萌发以及对植物激素和环境因素的响应[16]。在本研究中，通过产生几个GmRACK1下调或上调的转基因大豆株系，分析GmRACK1在种子萌发中的作用及其可能的机制。研究表明，GmRACK1通过增强ABA分解代谢和刺激H2O2产生来调节种子萌发。与野生型大豆(WT)种子相比，当GmRACK1下调时，种子萌发明显延缓，而GmRACK1的过表达对萌发有促进作用，但不显著。这与拟南芥和水稻种子萌发非常相似[11,17]。然而，目前对RACK 1如何调节种子萌发知之甚少。ABA参与维持种子休眠和抑制种子萌发，因此推测GmRACK1下调导致的萌发抑制可能与ABA有关，这一假设在本研究中得到了验证。实验表明，尽管外源ABA处理抑制了所有基因型的种子萌发，但GmRACK1下调对转基因大豆种子萌发抑制比非转基因株系和GmRACK1过表达转基因株系的种子萌发更敏感(图2、图3)。这一现象表明GmRACK1是大豆种子萌发过程中ABA作用的负调节因子，这与之前的结果非常相似，即ABA处理后，RACK 1负调节拟南芥种子萌发、子叶绿化和根系生长[18]。

3.2 GmRACK1抑制表达大豆种子内源ABA水平升高是由于ABA分解代谢减少

对吸胀种子内源ABA水平的分析表明，GmRACK1下调转基因大豆株系吸胀种子内源ABA水平显著高于野生型和GmRACK1过表达转基因大豆株系的种子内源ABA水平(图6)。这些结果很好地解释了在相同条件下GmRACK1下调转基因大豆种子萌发延迟的原因。但是，GmRACK1下调的转基因大豆株系的内源ABA水平升高和种子萌发延迟并非由于ABA生物合成的增强，因为ABA生物合成抑制剂氟啶酮处理没有显著增强发芽率，而ABA分解代谢抑制剂烯唑醇处理却显著降低了种子发芽率(图2)。这些结果表明，GmRACK1下调的转基因大豆种子内源ABA水平升高的主要原因是ABA分解代谢减少，从而导致种子萌发延迟。目前对GmRACK1调控种子萌发过程中ABA代谢的分子机制还不甚明了，值得进一步研究。

3.3 GmRACK1可通过种子中ROS来调节种子萌发

ROS在种子休眠缓解、后熟和萌发中起重要作用[19]。尽管活性氧长期以来被认为是对植物有害的物质，但最近的许多研究提供了生理学和遗传学证据，表明活性氧在种子萌发过程中也可能作为环境信号的信使分子发挥作用。例如，拟南芥[20]、小麦[21]等种子萌发和内部ROS含量和ROS清除系统的活性密切相关。本研究表明，GmRACK1也可能通过调节吸收种子中ROS的产生来调节种子萌发。例如当用外源H2O2处理时，所有基因型的种子萌发率增加，并且GmRACK1下调的转基因大豆株系的萌发对H2O2更敏感(图2)，这与其他一些物种种子萌发情况一致[22-23]。此外，比较不同大豆基因型的种子发芽率和吸胀种子内源H2O2水平，发芽率越低，内源H2O2水平就越低。例如，在吸胀48 h后，野生型和GmRACK1下调的转基因大豆株系的H2O2相对内源水平分别为1.24和0.76(图5)。这些结果表明，GmRACK1也可能控制吸收种子的H2O2生成。