碱蓬内生菌对西瓜幼苗盐胁迫的缓解效应

陈 昆， 王红军， 周银芝

(1.商丘市农林科学院，河南商丘 476000； 2.商丘职业技术学院，河南商丘 476000； 3.河南省柘城县农业农村局，河南柘城 476000)

西瓜营养丰富和含水量较高，是人们消暑解渴的重要瓜果之一。2018年我国西瓜总产量约6 302万t，约占世界西瓜总产量的3/5，可见西瓜已成为农民增收的主要经济作物之一，在我国农业经济发展中占有重要地位。早春保护地西瓜较露地西瓜提早20～40 d上市，同时同一品种在甜度、口感等品质上又优于露地种植，这使得保护地西瓜能够以较高的价格提前占有市场，为种植户带来较高的经济效益。市场的巨大需求和可观的经济回报，使得保护地西瓜种植面积呈现逐年扩大的趋势，但保护地西瓜产量和品质随种植年限的增加表现出逐渐下降的趋势。这其中一个主要原因是设施土壤盐渍化，保护地因棚膜覆盖常年得不到雨水淋洗，棚内蒸发量大，盐分随着土壤水分的蒸腾被传送到地表。另外，西瓜是需肥量较高的作物，肥料的过量施用使盐分在土壤中聚集，进一步加重设施土壤盐渍化现象。盐渍化产生的盐胁迫通过渗透胁迫、离子毒害、活性氧积累、光合抑制等多种方式严重影响植物的生长发育进程，显著降低作物的产量和品质。因此，改善作物根际微环境，提高保护地西瓜抗盐胁迫能力，对西瓜优质高产和可持续发展有着十分迫切的现实意义。

植物内生菌(endophyte)是指那些将其全部或部分生活史生活于健康植物各种组织和器官内部，又不引起植物明显危害的一类微生物。植物内生菌具有丰富的多样性，并在植物体内广泛存在。有研究表明，在长期的进化过程中大多数内生菌与植物形成了较为稳定的生态互惠共生关系，内生菌从植株体内获取营养物质并得以延续，而植物则利用内生菌分泌的次生代谢物(细胞分裂素、生长素、胡椒碱等)或借助其信号转导来增强抗盐碱、抗干旱、抗病菌、杀虫等抗逆境胁迫能力。另外，内生菌还能够通过影响植物的基因表达、调节抗逆代谢途径等增强植物抗逆性。Karthikeyan等研究发现，在盐胁迫条件下，内生菌通过诱导抗氧化酶活性的提高，增强清除机体活性氧(ROS)能力。Waller等研究得出，在逆境胁迫条件下，内生菌通过激活植物机体ASA-GSH代谢途径提高细胞抗氧化能力。Ghaffari等研究发现，内生菌可通过影响植株碳氮代谢水平和乙烯的合成来促进植物在盐碱胁迫环境中生长。韩庆庆等研究指出，被内生菌GB03侵染后的紫花苜蓿种子在盐胁迫处理后，株高和根长显著高于盐胁迫条件下未受GB03侵染的处理。Khan等研究得出，内生细菌 SAK1 侵染大豆植株后，其分泌的ACC脱氨酶、植株激素和抗氧化剂能增强植株耐盐胁迫能力。可见，内生菌在抵御植株逆境胁迫、提高抗逆能力、促进作物生长方面有重要的研究和利用价值。然而，当前有关内生菌尤其是碱蓬内生菌在西瓜抵御盐胁迫方面的应用研究尚未见详细报道。盐碱地碱蓬生活在逆境条件下，从中分离出来的内生菌因可以生活在这种极端逆境下而具有许多其他生物所没有的重要生理特性，有着十分重要的利用价值和科研价值。本试验通过碱蓬内生菌侵染西瓜幼苗植株，研究碱蓬内生菌液对盐胁迫下西瓜根际土壤微生物群落结构、土壤酶活性、根际构型、矿质离子平衡及碳氮代谢的影响，探究碱蓬内生菌提高西瓜幼苗耐盐性的机理，为设施西瓜的优质高产可持续栽培提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

由商丘市农林科学院提供西瓜自交系亲本材料HG-1。碱蓬内生菌JPE8-1由从山东省东营市盐碱地采集的碱蓬植株内分离获得。

1.2 NaCl胁迫浓度的选择

经试验测定，碱蓬内生菌菌株JPE8-1在NaCl浓度0.1～1.6 mol/L范围内生长良好。因此，选择既适宜JPE8-1生长且又对西瓜产生盐胁迫的NaCl浓度进行本次试验研究，NaCl浓度定为 0.14 mol/L。

1.3 试验设计

选取长势基本一致的2叶1心西瓜幼苗，移栽至高15 cm、直径15 cm的塑料盆中，缓苗7 d后进行胁迫试验。试验时，对照处理只添加清水 200 mL/盆，NE0处理浇灌0.14 mol/L NaCl溶液 200 mL/盆，NE1、NE2分别浇灌相应的内生菌液 200 mL/盆，14 d后对相关指标进行测定。

1.4 指标测定与方法

利用平板稀释计数法测定土壤微生物数量，用牛肉膏蛋白胨培养基分离培养细菌、改良高氏1号合成培养基分离培养放线菌、马丁氏培养基分离培养真菌。采用靛酚比色法测定脲酶活性，磷酸苯二钠法测定磷酸酶活性，3，5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶活性，高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶活性。使用由杭州万深检测科技有限公司提供的彩色平台式扫描仪(产品型号：LA-S根系分析独立版)测定根系生长指标。采用火焰分光光度计法测定植株钠、钾离子含量。用等离子光谱仪(ICP-OES-Optima 8x00)测定钠、钾、钙离子含量。利用分光光度计法测定蔗糖磷酸合成酶(SPS)、蔗糖合成酶(SS)、 酸性蔗糖转化酶(AI)活性，硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)和谷氨酸脱氢酶(GDH)活性均采用Solarbio公司生产的标准试剂盒进行测定。

1.5 数据处理

利用Microsoft Excel 2007进行数据图表处理，用SPSS 25.0软件对数据进行统计分析，运用Duncan’s 新复极差法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 碱蓬内生菌对西瓜幼苗根际土壤微生物群体结构的影响

由表1可知，NE0、NE1、NE2处理细菌数量均显著低于对照，且以单纯盐胁迫NE0处理值最低，较对照降低56.71%；NE1、NE2处理细菌数量较NE0分别增加83.38%、100.80%，表明内生菌侵染西瓜根系后能够提高根际土壤细菌数量，且以改良后的NE2处理效果较好。在NE0处理下细菌占比较对照显著下降，NE1、NE2处理细菌占比较对照提高，说明盐胁迫能够降低微生物群落结构中细菌比例，而内生菌能够提高细菌在微生物群落结构中的占比。放线菌数量以CK值最大，NE2处理次之，NE1处理第3，NE0处理值最小，而放线菌占比以NE0处理值最大，NE2处理值最小。NE0处理真菌数量和占比显著高于对照和其他处理，NE1、NE2处理真菌数量均显著低于NE0，但仍高于对照CK，表明盐胁迫能提高微生物群落中真菌占比，而内生菌能消减盐胁迫条件下真菌在微生物群落结构中的占比。

表1 碱蓬内生菌对西瓜幼苗根际土壤微生物群体结构的影响

2.2 碱蓬内生菌对西瓜幼苗根际土壤酶活性的影响

由表2可知，NE0、NE1、NE2处理下脲酶活性均显著低于对照，但NE1、NE2处理脲酶活性显著高于NE0处理，较NE0分别增加62.07%、82.76%，这说明内生菌能够有效缓解高盐胁迫对脲酶活性的抑制，促进有机碳的转化和积累。磷酸酶在对照CK、NE0、NE1、NE2处理间差异均显著，其中NE0磷酸酶活性最低，而NE1、NE2处理均显著高于NE0处理，且以NE2处理磷酸酶活性最大，这表明改良后的碱蓬内生菌液能够在高盐逆境条件下显著增加磷营养供应。蔗糖酶活性以对照CK最高，NE2处理次之，二者差异不显著；蔗糖酶在NE1、NE2处理间差异不显著，但均显著高于NE0，较NE0分别增加24.92%、33.23%，这说明碱蓬内生菌侵染西瓜幼苗后能够为西瓜幼苗提供较多的碳素。NE0处理下过氧化氢酶活性最低，较对照降低41.35%，与对照差异显著(<0.05)；NE1、NE2处理过氧化氢酶活性均显著高于NE0，较NE0增加52.46%、59.84%，这说明碱蓬内生菌能够有效减轻活性氧对西瓜幼苗根系的伤害。

表2 碱蓬内生菌对西瓜幼苗根际土壤酶活性的影响

2.3 碱蓬内生菌对盐胁迫下西瓜幼苗根系构型的影响

由表3可知，单纯的NaCl高盐胁迫NE0能够显著降低西瓜幼苗总根长、主根长、根尖数、根粗、根表面积和根总体积， 说明高盐胁迫能够抑制西瓜幼苗根系形态建成。添加有碱蓬内生菌液的NE1、NE2处理各形态指标虽然均低于对照，但均显著高于NE0处理，表明碱蓬内生菌液能够有效缓解NaCl对西瓜幼苗根系生长的逆境胁迫。NE2各生长指标均对应高于NE1处理，表明改良后的内生菌液效果更佳。NE2处理西瓜幼苗总根长、主根长、根尖数、根粗、根表面积和根总体积较NE0分别增加47.72%、59.44%、43.87%、96.30%、79.04%、74.70%，与NE0差异显著(<0.05)。

表3 碱蓬内生菌对盐胁迫下西瓜幼苗根系构型的影响

2.4 碱蓬内生菌对盐胁迫下西瓜幼苗矿质元素平衡的影响

由表4可知，在单纯高盐胁迫NE0处理下，西瓜地下部、地上部K、Ca、K/Na、Ca/Na含量均显著低于对照，而Na含量显著高于对照，表明高盐胁迫能够使西瓜幼苗遭受离子毒害。NE1、NE2处理下的西瓜地下部、地上部K含量和K/Na、Ca/Na比值均低于对照，地下部Ca含量低于对照，但均显著高于NE0处理，且NE2处理较好，表明碱蓬内生菌能够促进西瓜根系对营养元素的吸收利用，使植株细胞维持较高的渗透势，保证细胞正常的生理代谢活动。NE2处理地下部和地上部Na含量较NE0处理分别降低45.96%、54.33%，二者差异显著(<0.05)；NE2处理地下部和地上部K、Ca含量较NE0处理分别增加48.77%、30.95%和35.29%、39.92%，二者差异显著(<0.05)；NE2处理地下部和地上部K/Na、Ca/Na比值较NE0处理分别增加176.11%、142.86%和198.29%、206.73%，二者差异显著(<0.05)。

表4 碱蓬内生菌对盐胁迫下西瓜幼苗矿质元素平衡的影响

2.5 碱蓬内生菌对西瓜叶片碳代谢的影响

由表5可知，盐胁迫能够显著降低蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶活性，而碱蓬内生菌能够缓解盐胁迫对这2种酶的抑制作用。蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶活性在NE0处理下较对照分别降低30.67%、30.17%，与对照差异显著(<0.05)；蔗糖磷酸合成酶、蔗糖合成酶在NE1、NE2处理下均显著高于NE0，且以NE2处理下活性最大。3个处理酸性蔗糖转化酶活性均显著高于对照，且以NE0处理值最大，较对照增加29.59%。

2.6 碱蓬内生菌对西瓜叶片氮代谢的影响

由图1可以看出，盐胁迫(NE0)能够显著降低西瓜叶片硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性，显著提升谷氨酸脱氢酶(GDH)活性，其中谷氨酸脱氢酶活性较对照提高27.32%。添加有内生菌液的NE1、NE2处理硝酸还原酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成酶活性均低于对照，但均显著高于NE0，说明碱蓬内生菌能够有效消减盐胁迫对氮代谢酶的抑制作用。NE2处理下硝酸还原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、谷氨酸合成酶(GOGAT)活性较NE0分别增加43.07%、36.29%、46.58%。NE0处理谷氨酸脱氢酶活性最大，较对照增加27.32%，与对照差异显著(<0.05)；NE1、NE2处理亦高于对照，但NE1与对照差异不显著(>0.05)。

表5 碱蓬内生菌对西瓜叶片碳代谢相关酶活性的影响

3 讨论与结论

研究表明，土壤中细菌比例降低和真菌比例增加，容易出现土壤微生态失衡，诱发作物土传真菌病害的流行，对作物长势、产量和品质造成不利影响。本试验结果表明，高盐胁迫能够显著降低西瓜幼苗根际土壤细菌数量和细菌占比，显著增加真菌数量和真菌占比，这意味着在盐胁迫条件下西瓜幼苗根际微生物群落结构将由易于保持平衡且对作物生长有利的细菌主导型向易发土传病害的真菌主导型转变，不利于西瓜植株的形态建成和后期产量与品质的提高。NE1、NE2处理下西瓜根际土壤细菌数量和占比较NE0处理增加，而真菌数量和占比较NE0处理减小，这表明碱蓬内生菌能够抑制土壤微生物群落结构由细菌型向真菌型转变，维持土壤微生物群落结构的相对稳定，为西瓜植株的生长创造相对适宜的根际环境。碱蓬内生菌侵染西瓜根系后维持了盐胁迫条件下微生物群落结构的相对稳定，其原因应该是植物内生菌可以在生态位上与土壤微生物进行竞争，通过产生有机酸、抗菌活性物质、降解酚类化感物质等影响微生物生长，进而调节微生物区系，如内生菌通过细胞壁降解酶几丁质、-1，3-葡聚糖酶等降解真菌细胞壁以改变微生物区系，通过降解酚类等化感物质，解除其对土壤微生物和植物的毒害作用，为根系创造良好生长环境，进而增加植株根系分泌物的种类和数量，根系分泌物的增多又促进了微生物种类和数量的提高。

土壤酶是一种具有特殊催化能力的生物催化剂，其催化能力是无机催化剂的几十倍乃至几百倍，对土壤有机质的分解和土壤养分的转化有极其重要的作用，与植物生长关系密切。脲酶在土壤中可促进尿素的分解，为植株生长提供氮素。磷酸酶能够促进土壤有机磷的分解和转化，为植物生长提供磷素。蔗糖酶是分解土壤碳水化合物的重要酶类，其活性高低常用于衡量土壤碳水化合物分解与转化的速率，可为植物生长提供碳源。过氧化氢酶能够防止过氧化氢对生物体的毒害，通过维持活性氧的平衡促进植株的健康生长。周德平等研究得出，土壤脲酶、过氧化氢酶、转化酶和蛋白酶活性与盐胁迫强度具有显著的负相关关系，即盐浓度越高酶的活性越低。本试验结果表明，在单纯高盐胁迫NE0处理下，西瓜根际土壤酶活性均显著低于对照，试验结果与前人研究结论一致，说明高盐胁迫产生的离子毒害能够抑制土壤酶活性的提高。NE1、NE2处理下西瓜根际土壤脲酶活性虽然低于CK，但显著高于NE0处理，说明碱蓬内生菌能够提高西瓜根际土壤氮素循环，促使含氮化合物向有效态氮转化，提高西瓜根系对氮素的利用率。NE1、NE2处理下西瓜根际土壤磷酸酶活性显著高于NE0处理，说明碱蓬内生菌侵染西瓜后通过向外界分泌次生代谢物影响磷酸酶活性，促使土壤中难溶性磷向植物易吸收的速效磷转化，提高土壤供磷水平。NE1、NE2处理下西瓜根际土壤蔗糖酶活性显著高于NE0处理，说明碱蓬内生菌能够通过提高蔗糖酶活性，加速土壤碳循环，为植物生长和微生物生命活动提供碳源。由此推断，碱蓬内生菌JPE8-1对西瓜的促生作用，也可能与JPE8-1能够改善西瓜根际土壤酶活性有关。试验结果与王宏伟等的研究结论一致。

根系与土壤直接接触，是最先感受到盐分胁迫且对盐胁迫反应又最为敏感的器官，在遭受盐胁迫时根系渗透势降低、根系对水分和矿质元素吸收能力下降、根系吸收面积减小，进而影响植株的生长发育。生长抑制是对盐碱胁迫的直接响应，是评价植物耐盐性强弱的重要指标。本试验条件下，单纯的NaCl高盐胁迫NE0处理西瓜幼苗总根长、主根长、根尖数、根粗、根表面积和根总体积显著低于对照，试验结果与王素平等在黄瓜上的研究结果一致，这表明盐胁迫不利于西瓜幼苗根系的正常生长发育，根系构型特征恶化。这是因为高盐胁迫能够降低根系细胞渗透势，使细胞膜发生膜脂过氧化反映，破坏细胞膜结构，影响根系对矿质营养元素和水分的吸收，最终引起根系生长受到抑制。另外，盐胁迫能够提高叶绿素酶对叶绿素的降解速度，并使叶绿素的合成受阻，同时通过改变类囊体的膜结构来降低叶绿体对光能的捕获的能力，致使光合能力减弱，光合产物合成减少，根系生长受到抑制。植物内生菌能够分泌次生代谢产物，这些代谢产物不仅能够显著刺激宿主植物的生长发育，还能明显提高宿主植物抵御生物和非生物逆境胁迫能力，增强植物抗逆性。本研究结果表明，与NE0相比，添加内生菌的NE1、NE2处理能够显著增加西瓜幼苗总根长、主根长、根尖数、根粗、根表面积和根总体积，且NE2处理更佳，试验结果与付艳萍等在内生菌感染向日葵幼苗上的研究结论一致，这可能是因为内生菌能够分泌生长素、细胞分裂素、赤霉素等植物生长所需的生长物质。生长素对植物细胞的伸长和生长有重要作用，细胞分裂素具有促进植物细胞分裂和生长尤其是根系细胞分裂和生长的作用，促进植株对外界营养物质的吸收利用。同时，内生菌分泌的胞外多糖可使土壤孔隙度等土壤结构发生改变，增强根系对土壤水分变化的适应能力，有利于根系的伸长生长。另外，内生菌侵染植株后有利于叶片光合色素含量的增加，光合能力增强、干物质积累的增加为根系生长提供了物质基础。改良后NE2处理效果较NE1处理好，除与内生菌有关外，还应该与改良内生菌液中添加了植株生长所必须的N、K营养元素有关。

高盐胁迫能够扰乱植株体内的离子平衡，减少细胞K和Ca含量。本试验条件下，单纯盐胁迫NE0处理K离子含量显著低于对照，这可能是因为高盐胁迫下被植株吸收的K离子通过韧皮部传导至根部后被外渗出来，也可能是因为高浓度的Na抑制K的吸收。NE0处理西瓜幼苗地上部和地下部Ca含量均显著低于对照，说明高盐胁迫使西瓜幼苗遭受离子毒害，离子平衡被打破，其原因应该是Na与Ca的离子半径相似，Na能够取代质膜上的Ca，降低膜的选择通透性，盐离子的大量涌入打破机体原有的离子平衡。接种内生菌的盐胁迫处理NE1、NE2的西瓜幼苗地下部和地上部K、Ca含量均高于NE0，说明内生菌能够缓解盐胁迫对根系吸收营养元素的抑制作用，使植株保持较高的渗透势以适应外界的盐胁迫环境。这应该是因为植物在遭受逆境胁迫时会刺激机体代谢产生乙烯，而乙烯对植株根系的生长发育有严重的抑制作用，进而影响根系对外界营养元素的吸收利用。内生菌在逆境条件下，可通过调控氨基环丙烷羧酸脱氨酶来抑制乙烯的合成，减少机体乙烯含量，降低非生物胁迫对植物生长的影响，提高根系对营养元素的吸收利用率，促进植株生长发育。另外，磷钾肥施入土壤后往往以磷酸盐和含钾硅酸盐的形式存在于土壤中，肥料利用率较低，而内生菌通过调节根系微环境pH值，分泌酸性磷酸酶矿化有机磷，溶解磷酸盐，螯合矿质元素，参与离子交换，提高根系对P、K等营养元素的吸收利用率。在盐胁迫条件下，盐分离子与其他矿质元素间的交互作用可以影响植株的长势状况，盐胁迫造成的离子代谢失衡是植株长势减弱的重要原因之一。盐胁迫下细胞内离子代谢失衡的一个重要参考指标是K/Na比值下降。在盐胁迫条件下，耐盐植株通过多种方式限制Na的吸收，保持较高的K浓度，保持较高的K/Na比值，降低离子毒害作用。另外，K与气孔开闭有关，维持较高的K/Na比值是植株在盐胁迫环境下保证气孔正常功能和许多代谢正常进行的前提。本试验条件下，NE1、NE2处理K/Na比值均显著高于单纯盐胁迫NE0，说明西瓜幼苗接种碱蓬内生菌后能够增强机体耐盐水平，同时为西瓜后期品质的提高提供了物质基础。