D101大孔树脂纯化山银花总皂苷的工艺研究

★ 郭慧玲 罗江南 胡律江 赵晓娟（江西中医药大学 南昌 330004）

山银花（Lonicerae flos）又名大银花，是忍冬科植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoidesHand-azz.、红腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.、华南忍冬LoniceraconfuseDC.或黄褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosaHsu et S.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花，要分布于湖南、广东、四川等南方多省。具有清热解毒、疏散风热的功效,主要用于温病发热、喉痹、热毒血痢、风热感冒等病症［1］。山银花中主要含有机酸类、黄酮类、三萜皂苷类、挥发油类等化学成分。山银花所含皂苷类成分较金银花高［2］，且关于山银花皂苷类成分的药效研究还不完善，为研究山银花总皂苷成分的药效作用，故使用大孔树脂对山银花中总皂苷成分进行分离纯化，对其工艺及其含量测定方法进行研究。

大孔吸附树脂为皂苷类成分常用的分离纯化方法，其吸附原理为范德华引力或生成氢键而产生的一种表面吸附现象［3］；同时由于大孔吸附树脂的多孔结构使其具有分子筛作用［4］。通过吸附和分子筛原理，有机化合物根据吸附力的不同及分子量的大小，在大孔吸附树脂上经一定溶剂洗脱而达到分离、纯化、除杂、浓缩等不同目的，且具有选择性高、干扰因素少、可重复循环利用等特点［5］，广泛应用于化工、医药、食品、农业等领域［6］。

本实验采用比色法测定山银花提取物和各个洗脱物中总皂苷的含量，并以此为指标，探究山银花总皂苷最佳的上样浓度，洗脱流速，动态吸附泄露曲线等分离纯化工艺，为山银花药材进一步开发利用提供有力依据。

1 材料

HH-2型数显恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；DHG-9023A型电热恒温鼓风干燥箱（苏州江东精密仪器有限公司）；KQ5200DA型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；RE-52A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D（Ⅲ）型循环水多用真空泵（郑州杜甫仪器厂）；Q/TBCR1型752-紫外可见分光光度计（上海欣茂仪器有限公司）；山银花药材（产自湖南，购于樟树市庆仁中药饮片有限公司，批号：190428 经由江西中医药大学邓可众副教授鉴定为忍冬科植物灰毡毛忍冬的花蕾）；灰毡毛忍冬皂甘乙标准品（批号：111814-201604，纯度为94.4% 中国食品药品检查研究院）；D101大孔树脂（沧州宝恩吸附材料科技有限公司）；冰醋酸 （分析纯，西陇科学股份有限公司）；香草醛（型号：V8080，索莱宝生物科技有限公司）；高氯酸（天津市大茂化学试剂厂）；层析柱（规格：2 cm×23 cm，江苏汉邦科技）；乙醇（分析纯，西陇科学股份有限公司）。

2 实验方法与结果

2.1 供试品和对照品的制备

2.1.1 山银花水提液的制备 称取山银花药材适量，液料比为15∶1，加热回流2 h，提取2次，过滤，合并滤液，将滤液浓缩，获得不同浓度的山银花水提液。

2.1.2 对照品溶液的配制 精密称取灰毡毛忍冬皂苷乙对照品10 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，获得1 mg/mL对照品溶液。

2.2 山银花水提液总皂苷含量测定方法

参照文献精密吸取山银花水提液适量，水浴挥干溶剂后依次精密加入新配的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2 mL和高氯酸0.6 mL，加塞混匀后于70 ℃水浴锅中恒温加热30 min，加热后取出水浴冷却，再加入5 mL冰醋酸，摇匀，利用紫外分光光度法于477 nm处测定吸光度［7］。

2.3 D101大孔树脂对山银花总皂苷的吸附及解吸附性能考察

2.3.1 树脂预处理 取大孔吸附树脂于适当的锥形瓶中，加入无水乙醇浸泡24 h后，用无水乙醇冲洗大孔树脂至醇与水混合（1∶5）不产生白色混浊，在用大量蒸馏水冲洗至无醇味，备用。

2.3.2 静态吸附时间考察 称取2 g干树脂于锥形瓶中，预处理后，加入0.2 g/mL的药液20 mL，置于25 ℃恒温摇床中振荡，分别于0，1，5，8，11，13，24 h取样测定药液中总皂苷浓度，得到总皂苷浓度与时间关系。见图1。

图1 静态比吸附量与时间关系图

静态比吸附量=（样品总皂苷质量-吸附后总皂苷质量）/树脂质量

当树脂吸附药液5 h后，药液中的总皂苷浓度变化不大，可在药液上样后吸附5 h再进行洗脱。

2.3.3 上样浓度的考察

称取5 g已完成预处理的干树脂5份，装柱，以1 mL/min的上样速度，分别向树脂中加入0.1，0.2，0.3，0.4，0.5 g/mL的药液30 mL，吸附5 h后，用5 BV的水（水洗量）和5 BV的70%乙醇（洗脱量）进行洗脱，测定比吸附量和解吸率。见图2。

图2 不同上样溶度对比吸附量和解吸量的影响

由图可知，随着上样溶度的增大，比吸附量逐渐增大，解吸率随着上样溶度的增大而降低，综合考虑，选择0.2 g/mL为最佳上样浓度。

比吸附量（mg/g）=（上样量-流出量-水洗量）/树脂质量

解吸率（%）=洗脱量/吸附量

2.3.4 洗脱流速的影响 称取5 g已完成预处理的干树脂5份，装柱，以1 mL/min的上样速度，向层析柱中加入0.2 g/mL山银花药液30 mL，吸附5 h后，分别以1，2，3，4 mL/min的流速用5 BV的水和5 BV的70%乙醇进行洗脱，测定比吸附量和解吸率。见图3。

图3 不同洗脱流速对比吸附量和解吸量的影响

由图可知，随着洗脱流速的增加，比吸附量逐渐降低，而解吸率在洗脱流速为3 mL/min时最大，不同洗脱流速对比吸附量的影响差异不大，综合考虑，选择3 mL/min为最佳洗脱流速。

2.3.5 洗脱溶媒的考察 称取10 g已完成预处理的干树脂，湿法装柱，向树脂中加入0.2 g/mL的药液60 mL，反复上样多次，静置吸附12 h，先用蒸馏水冲洗5 BV，依次用10%，20%，30%，50%，70%，95%乙醇洗脱5 BV,收集每个柱体积为1个流份，测定总皂苷含量。见图4。

图4 乙醇体积分数对总皂苷洗脱效果的影响

由图可知，10%，20%，30%，95%乙醇洗脱液中都含有少量总皂苷成分，总皂苷主要集中于50%和70%乙醇洗脱液中，70%乙醇能洗脱能力较强，20%和30%乙醇除杂能力相近，故需要对20%，30%乙醇除杂试剂进行筛选。综合考虑，以20%或30%乙醇溶液进行除杂，再使用70%乙醇洗脱。

2.3.6 动态吸附泄露曲线的测定 称取10 g已完成处理的干树脂，湿法装柱，向树脂中缓缓加入0.2 g/mL的药液125 mL，控制药液流出速度1 mL/min，每5 mL收集流出液作为1个流份，对收集的所有流份进行总皂苷测定。见图5。

图5 山银花总皂苷动态吸附泄露曲线

由图可知，第3个流份中含有少量总皂苷成分，但浓度不超过上样也浓度的10%，第4个流份中的总皂苷含量突然增加，说明皂苷大量流出，为树脂的泄露点；第15个流份以后总皂苷浓度基本不改变，说明树脂吸附达到了饱和，为树脂饱和点。

2.3.7 除杂试剂的考察 称取10 g已完成处理的干树脂2份，湿法装柱，向树脂中加入0.2 g/mL的药液15 mL，反复上样多次，静置吸附5 h，先用蒸馏水冲洗5 BV，再分别用5 BV的20%乙醇和30%乙醇洗脱，最后用5 BV的70%乙醇洗脱,洗脱流速为3 mL/min，收集每个浓度的洗脱液，测定总皂苷含量及除杂后70%乙醇总皂苷纯度。见表1。

表1 除杂试剂总皂苷含量及纯度表

由表可知，20%乙醇和30%乙醇都能洗脱出一定量的总皂苷成分，经过除杂后，70%乙醇洗脱液中总皂苷纯度分别为64.76%和78.93%，30%乙醇除杂后的纯度较高，故选择30%乙醇作为除杂试剂。

2.3.8 水、除杂试剂、洗脱剂用量的考察 称取10 g已完成预处理的干树脂，湿法装柱，向树脂中加入0.2 g/mL的药液15 mL，反复上样多次，静置吸附5 h，先用蒸馏水冲洗5 BV，依次用5 BV的30%乙醇，5 BV的70%乙醇洗脱，洗脱流速为3 mL/min，每0.5 BV收集为1个流份，测定总皂苷含量。见图6、图7。

图6 10个流份中总皂苷含量变化曲线图

图7 70% 乙醇洗脱液流份中总皂苷的含量变化曲线

水和除杂试剂的第4、第5个流份中的总皂苷含量很低，且经过HPLC测定10个流份中的绿原酸含量，第5个流份中含有的绿原酸成分较高，第9个和第10个流份中的绿原酸含量极低。即确定水洗量为5 BV，30%乙醇用量为3 BV。

2.4 山银花水提液中总皂苷的纯化工艺验证试验

称取预处理好的D101树脂3份，每份10 g，湿法装入玻璃层析柱中，用水洗涤平衡备用。取15 mL 0.2 g/min的山银花提取物水溶液上大孔树脂柱，以1 mL/min体积流量吸附，静置5 h后，再用蒸馏水5 BV，30%乙醇3 BV，70%乙醇3 BV以3 mL/min的流速进行洗脱，收集洗脱液，比色法测定洗脱液中总皂苷的量并计算总皂苷纯度。结果表明，总皂苷平均纯度为79.01%，表明优选的工艺稳定，纯化效果好。见表2。

表2 纯化前后总皂苷纯度比较 %

3 讨论

本次实验以D101大孔树脂作为吸附剂对山银花总皂苷分离纯化最佳工艺进行探究，最后确定了分离纯化的工艺为：最佳上样浓度0.2 g/mL，最佳洗脱流速为3 mL/min，上样后吸附时间为5 h，蒸馏水用量为5 BV，除杂试剂为30%乙醇3 BV，洗脱试剂为70%乙醇3 BV，在此条件下，能得到纯度较高的总皂苷粉末。表明摸索的工艺较稳定，纯化效果较好。

对山银花水提液总皂苷的纯化工艺试验的过程中，通过分析得到的各实验数据发现：（1）实验过程中实验室温度对实验的影响较大，温度太低会使得药液中一些成分溶解度下降，从而析出固体物质，使溶液变为混悬状态，影响药液在树脂中的分布情况，并且析出的固体物质可能会对药液的吸附产生干扰。（2）注意对提取液的处理，山银花提取液提取浓缩后会形成混悬液，混悬液中的固体并不会被树脂吸附，所有对上样液的处理也同样非常重要。（3）山银花中含有黄酮类成分，而大孔树脂对黄酮类物质也具有特异性吸附，黄酮类成分和总皂苷成分的洗脱范围相似，所以要分离出总皂苷成分，需要在洗脱前对黄酮类物质进行除杂。

大孔树脂吸附法纯化山银花中的总皂苷是一种比较高效率的纯化方法，有操作简单，条件温和，节约成本，耗时较短等优点，后期可针对影响大孔树脂吸附的其他因素进行考察，进一步完善实验。