一个天麻共生蜜环菌菌株的培养基筛选

杨文权，刘 玲，吴 娜，张跃进，孙建华，张小燕

(1.西北农林科技大学 生命科学学院，陕西 杨凌 712100；2.陕西汉王略阳中药科技有限公司，陕西 略阳 724300；3.西北农林科技大学 农学院，陕西 杨凌 712100)

蜜环菌(Armillariamellea)是属于担子菌门(Basidiomycota)伞菌目(Agaricales)泡头菌科(Physalacriaceae)蜜环菌属(Armillaria)非常重要的真菌[1]。因其含有多种倍半萜类化合物、多糖、氨基酸及各种微量元素等，具有免疫调节、护肝、抗肿瘤、抗衰老等药理作用和重要的食用、药用价值[2-4]。同时，蜜环菌又是名贵中药材天麻(Gastrodiaelata)的共生菌，而天麻没有根茎叶，只有开花时花茎才抽出地面，其余时间都在地下，营养来源全凭共生的蜜环菌供给，因此，蜜环菌是天麻生长中唯一的外来营养源，是天麻栽培中不可缺少的材料[5-6]。

蜜环菌菌种在生产中分为三个级别，一级母种用于保存和运输，二级原种用于扩大繁殖，三级栽培种用于生产栽培[7]。其中，一级母种培养基可以确保蜜环菌得以良好保藏和运输，三级栽培种培养基可以确保生产出优良、健壮的蜜环菌，服务天麻生产，因此，在蜜环菌生产中非常重要。蜜环菌生长过程中需要不同的营养源，主要包括碳源、氮源、无机盐等[8]，已有研究表明，虽然蜜环菌可利用多种营养源，但对最有效利用的营养源有选择[9]，因此，不同配方的母种和栽培种培养基上，蜜环菌的生长情况不同。在适宜的培养基上，蜜环菌萌发速度快，菌索白嫩、粗壮，分枝多，生物量大，不仅可以缩短蜜环菌培养时间，降低蜜环菌生产成本，而且培养的蜜环菌健壮，在天麻栽培过程中可快速形成菌索侵染菌棒，与天麻建立共生关系后，尽早为天麻提供营养，提高天麻产量和质量[10-11]。虽然蜜环菌母种和栽培种培养基配方已有很多研究，但由于菌株不同，研究结果差异较大，在实际中无法通用[9,12]。为此，本试验拟以宁强真菌研究所分离的1株蜜环菌MC4为对象，研究其最佳的一级母种和三级栽培种培养基，给该蜜环菌的商品化及蜜环菌的育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

供试蜜环菌菌株编号MC4，由宁强真菌研究所分离提供，经rDNA-ITS序列分析鉴定为蜜环菌(Armillariamellea)。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株的活化 将MC4母种从冰箱取出，室温黑暗放置24 h，接种到PDA平板中央，于25 ℃黑暗下培养，待菌索长满平板备用。

1.2.2 蜜环菌母种培养基配方

(1)不同碳源培养基

1 L培养基，加碳源(红薯淀粉、马铃薯淀粉、玉米粉、麦芽浸粉)20 g，蛋白胨10 g，MgSO41 g，KH2PO42 g、琼脂15 g。

(2)不同氮源培养基

1L培养基，加氮源(蛋白胨、酵母粉、大豆粉、牛肉膏)10 g，葡萄糖 20 g，MgSO41 g，KH2PO42 g，琼脂15 g。

(3)不同无机盐培养基

1L培养基，加无机盐(MnSO4、KH2PO4、FeSO4、MgSO4)2 g，葡萄糖20 g，蛋白胨10 g，琼脂15 g。

1.2.3 蜜环菌栽培种培养基配方

(1)Ⅰ号培养基

栎木木屑50%，棉籽壳30%，麸皮18%，石膏1%，生石灰0.5%，蔗糖0.4%,KH2PO40.1%，料水比1∶1.4 kg·L-1，装入5 cm×30 cm×5 cm聚丙烯袋，每袋250 g。

(2)Ⅱ号培养基

栎木枝条40%，水60%。其中，栎木枝条210 g，水315 mL，装入650 ml细口组培瓶。

(3)Ⅲ号培养基

栎木枝条50%，麸皮20%，木屑20%，玉米面7%，石膏1%，白糖2%，料水比1∶1.4 kg·L-1，装入5 cm×30 cm×5 cm聚丙烯袋，每袋250 g。

(4)Ⅳ号培养基

栎木枝条40%，马铃薯汁60%，其中马铃薯汁由去皮马铃薯200 g·L-1煮沸制成。其中，栎木枝条210 g，马铃薯汁315 ml，装入650 ml细口组培瓶。

1.2.3 培养基的制备 12种母种培养基分别按配方配制，装入18 mm×200 mm的试管，每管装35 ml，橡胶塞封口，121 ℃灭菌20 min，取出后自然冷却凝固，待用。4种栽培种培养基封口后121 ℃灭菌4 h，备用。

1.2.4 接种 母种培养基每试管接活化菌株1块(0.5 cm直径菌块)，栽培种每袋(瓶)接种活化菌株4块，每处理3个重复，25 ℃，黑暗培养。

1.3 测试指标

1.3.1 蜜环菌的吃料深度 蜜环菌深入试管、袋子或瓶中培养基的深度，每3 d测1次。

1.3.2 蜜环菌的生物量 培养45 d后，将试管中的培养基和蜜环菌菌索一起倒出，蜜环菌菌索与培养基分离后用蒸馏水冲洗，60 ℃烘箱烘12 h，称重。

1.3.3 菌索的直径 从袋子或瓶子外面，随机挑选10个菌索，测量其直径。

1.4 数据统计与分析

数据用Excel 2016进行初步处理，用SPSS18.0软件进行One-way ANOVA方差分析。

2 结果与分析

2.1 不同母种培养基对蜜环菌MC4的影响

2.1.1 不同碳源对蜜环菌MC4生长的影响 由图1可以看出，蜜环菌MC4在以红薯淀粉为碳源的培养基上菌丝萌发最早，第9 d开始萌发，在马铃薯淀粉培养基上菌丝萌发最晚，15 d以后才开始萌发。以麦芽浸粉为碳源的培养基菌丝萌发的最初一段时间生长迅速，在21 d时，吃料深度已达8.533 cm。在4种不同碳源培养基中，玉米粉培养基上蜜环菌的菌索生长速度最慢，36 d时，吃料深度只有3.833 cm，显著低于(P<0.05)在其它3个碳源培养基上的吃料深度。培养36 d时，以红薯淀粉、马铃薯淀粉及麦芽浸粉为碳源的3个培养基上培养的蜜环菌的吃料深度无显著差异(P>0.05)，均在12 cm左右(图1)。

图1 不同碳源的蜜环菌生长

在4种碳源培养基上，蜜环菌MC4的生物量差异较大，其中马铃薯淀粉为碳源的培养基上，菌株生物量最大，干重为0.191 g，显著高于(P<0.05)其它3种碳源培养基上的生物量；以玉米粉为碳源的培养基上，菌株MC4的生物量最少，只有0.050 g，显著低于(P<0.05)其它3个培养基上的生物量；4种碳源培养基上菌株生物量由大到小为：马铃薯淀粉>麦芽浸粉>红薯淀粉>玉米粉(图2)。

注：不同小写字母表示差异显著，下同。

2.1.2 不同氮源对蜜环菌MC4生长的影响 以大豆为氮源的培养基上，蜜环菌MC4菌丝萌发最晚，12 d以后才开始萌发。萌发后，在酵母粉培养基中，MC4的菌索生长最快，36 d时吃料深度为12.550 cm，显著高于(P<0.05)在其它3种培养基中的吃料深度(图3)。在牛肉膏培养基中，MC4的生长速度也较快，36 d时吃料深度为10.125 cm。在蛋白胨和大豆粉培养基中，MC4的生长速度较慢，36 d时吃料深度分别只有6.659 cm和6.400 cm，显著低于(P<0.05)酵母粉和牛肉膏培养基中的吃料深度。

图3 不同氮源的蜜环菌生长

氮源显著影响蜜环菌的生物量，从图4可以看出，在4种不同氮源培养基中，酵母粉培养基中的生物量最大，为0.481 g，显著高于(P<0.05)其它3种培养基中的生物量。

图4 不同氮源的蜜环菌生物量

大豆粉培养基中的生物量最低，只有0.119 g，显著低于(P<0.05)其它培养基中的生物量。4种培养基中菌株的生物量由大到小依次为：酵母粉>牛肉膏>蛋白胨>大豆粉。

2.1.3 不同无机盐对蜜环菌MC4生长的影响 4种不同无机盐对蜜环菌MC4的生长影响显著(图5)，在FeSO4培养基中，MC4的菌丝不萌发，随时间推移，培养基逐渐变褐变黑。在KH2PO4培养基中菌丝萌发最早，培养第9 d时开始萌发，而在MnSO4培养基中的萌发最晚，18 d以后菌丝才开始萌发。培养36 d时，KH2PO4培养基中的生长速度最快，吃料深度为5.700 cm，显著高于(P<0.05)在MgSO4和MnSO4培养基中的生长速度，其中，在MnSO4培养基中的生长速度最慢，只有1.740 cm。

图5 不同无机盐下蜜环菌的生长

从图6可以看出，培养基中添加不同无机盐后，蜜环菌MC4的生物量差异较大。由于添加FeSO4后，MC4没有生长，因此生物量为零。而在添加KH2PO4的培养基中，MC4的生物量最大，为0.182 g，显著高于(P<0.05)添加MgSO4和MnSO4培养基中的生物量。

图6 不同无机盐下蜜环菌的生物量

2.2 不同栽培种培养基对蜜环菌MC4的影响

2.2.1 不同栽培种培养基对蜜环菌MC4生长的影响 从图7可以看出，MC4在Ⅳ号培养基中培养时最先萌发，但前14 d均生长缓慢，14～20 d内生长迅速，后基本保持平稳速度生长，44 d时长满菌瓶。在Ⅰ号培养基中，MC4生长速度较快，33 d时已经长满。在Ⅲ号培养基中，MC4萌发最晚，12 d后菌丝才开始萌发，36 d时长满整个菌袋。在Ⅱ号培养基中，前18 d长势缓慢，后加速生长，48 d时吃料深度达10.833 cm，54 d时基本长满。

图7 不同三级栽培种培养基的蜜环菌生长

2.2.2 蜜环菌MC4在不同栽培种培养基上的形态特征 从表1可以看出，在Ⅰ号和Ⅲ号培养基上培养时，MC4的菌丝萌发较慢，接近10 d左右，菌索形成时间也较长，需要15 d左右。而在Ⅱ号和Ⅳ号培养基上培养时，菌丝不仅萌发时间较短，而且菌索形成时间也较快。但是，Ⅲ号和Ⅳ号培养基上形成的菌索较粗，直径均为0.45 cm，且均较Ⅰ号和Ⅱ号培养基上的菌索茂密。因此，菌株在Ⅳ号三级培养基中不仅萌发时间短，生长速度快，且菌索粗壮，分枝茂密。

表1 蜜环菌在不同三级栽培种培养基上的形态特征

3 结论与讨论

微生物生长需要碳源、氮源、无机盐等不同的营养物质[13]，碳源可提供菌体细胞的碳架和生命活动所需的能量，氮源是构成菌体蛋白质、核酸的不可或缺的原料，而无机盐可作为酶的组成部分、酶的激活剂或抑制剂等，参与代谢反应[14-15]。以往的研究表明，蜜环菌对营养物质要求并不严格，马铃薯淀粉、红薯淀粉、玉米粉、麦麸、葡萄糖、蔗糖等均是其优质的碳源，菜籽饼、蚕蛹粉、蛋白胨、酵母浸粉、尿素等均是其常用的氮源[9，16-18]，而KH2PO4、MgSO4、MnSO4、CaCl2等是常用的无机盐[8,17]。但是，由于不同营养物质的添加比例及不同菌株对营养物质的利用差异，因此直接影响蜜环菌的生长状况。如彭述敏对2株分离自昭通的蜜环菌的研究表明，葡萄糖为其最佳的碳源，酵母膏和蛋白胨为最佳的氮源，最适无机元素为K2SO4和KH2PO4[8]。李再新的研究表明，葡萄糖和酵母粉为蜜环菌培养最佳的碳、氮源[19]。程显好通过1株蜜环菌对15种碳源和6种氮源的研究表明，碳源因素对蜜环菌生长的影响大于氮源因素，在以甘露糖为碳源的培养基上生物量最高，但在不同氮源条件下，蜜环菌都能很好的生长，形态无显著差异[20]。

本试验结果也表明，以马铃薯淀粉为碳源、以酵母粉为氮源、以KH2PO4为无机盐的一级母种培养基上，蜜环菌MC4的生长速度及生物量显著高于其它培养基。这可能是因为相比马铃薯淀粉、红薯淀粉和麦芽浸粉，玉米粉的养分较少，所以不利于蜜环菌的生长，因此生长速度和生物量均较低，而蜜环菌虽然在红薯淀粉和麦芽浸粉培养基上的生长速度与马铃薯淀粉接近，但由于菌索分枝少、较细，因此生物量显著低于马铃薯淀粉培养基。与彭述敏[8]、闫军[21]试验所得蛋白胨是蜜环菌最佳氮源不同，本试验在以蛋白胨、酵母粉、大豆粉、牛肉膏为不同氮源的研究中发现，MC4在酵母粉培养基上的生物量最高，在大豆粉和蛋白胨中不仅吃料深度最浅，生物量也低。由此可知，不同菌株对氮源有不同喜好，以酵母粉为氮源的培养基更适合菌株MC4的生长。在添加不同无机盐的培养基中，蜜环菌MC4在添加了FeSO4的培养基中没有生长，无菌丝和菌索萌发，可能是因为FeSO4浓度过高，抑制了蜜环菌的萌发和生长[22-23]。与彭述敏[8]结果一致，MC4在添加KH2PO4的培养基上，生长最好，吃料深度最深，生物量显著高于其他处理。而在生产三级栽培种培养基时，不仅要考虑蜜环菌的生长速度，缩短培养时间，还要考虑生产成本和工艺的复杂性[24]。本试验研究表明，在以栎木枝条40%+马铃薯汁60%配制的Ⅳ号培养基上，不仅菌株萌发最早，生长最快，菌索最粗，而且生产成本低，工艺简单，易于操作，因此列为首选栽培种培养基。