山楂叶总黄酮中医食疗制剂制备工艺研究

薛宇彤，郑锦秀，2，邵 莹，梁泰刚，杨利军*

1.山西医科大学基础医学院，山西 030001；2.山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室；3.山西医科大学药学院

随着人们生活水平的提高，中医食疗得到越来越多人的认可。中医食疗是以中医理论为指导，选取具有药用价值的食物治疗疾病[1]。通过食疗，补充人体所需的营养素，使机体达到均衡营养的状态。黄酮类化合物是许多药用植物的有效成分，在自然界中广泛分布于水果、蔬菜、茶、植物根茎、花部位[2-3]，在水果、蔬菜中含量最高[4],是人体所需的天然营养素之一[5],在降血糖、降血脂、抗感染和抗肿瘤等方面发挥重要作用。山楂叶总黄酮是山楂叶的提取物，具有广泛的药理作用。益心酮片的主要成分是山楂叶的提取物[6]，临床用于治疗冠心病、心绞痛、高脂血症等病症，但该生物制剂尚未改变黄酮类化合物口服难吸收、生物利用度低的不足。脂质体是一种安全、无毒、具有靶向给药功能的新型药物制剂[7]，可以包封水溶性、脂溶性及两亲性的物质，在医药界、食品界及保健品界有着非常广泛的应用[8-10]，以增强食品的感官属性、保质期，增加产品的溶解度及生物利用度[11]。本研究以山楂叶提取物总黄酮为原料，采用薄膜分散-超声法制备脂质体，并通过正交试验优选脂质体的制备工艺，对其理化性质及贮藏稳定性进行探究，以期为后期开发食疗产品提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 大豆卵磷脂、胆固醇、芦丁标准品、吐温80（北京索莱宝科技有限公司）；二氯甲烷、无水乙醇、亚硝酸钠、无水三氯化铝、氢氧化钠、甲醇均为分析纯（天津风船化学试剂科技有限公司）。

1.2 仪器 SB25-12DTD 超声波清洗，UP-250 手提式超声波细胞粉粹机（宁波新芝生物科技有限公司）；Spectra Max 190 型酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；NanoZS 90 激光粒度仪（英国马尔文仪器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 山楂叶总黄酮脂质体的制备 参照涂清波等[12]研究方法稍作改动。采用薄膜分散-超声法制备山楂叶总黄酮脂质体。称取一定量的大豆卵磷脂、胆固醇、吐温80 按一定比例溶于二氯甲烷中，山楂叶黄酮溶于70%乙醇中，充分溶解后置于茄形瓶中，低压旋转蒸发除去有机溶剂，待形成薄膜后，加入一定量磷酸盐缓冲液（PBS）水化洗膜，将悬浊液经过超声波细胞粉碎机在一定功率下超声一定时间，最后过0.45 μm 滤膜，即得脂质体。

1.3.2 单因素考察

1.3.2.1 卵磷脂与胆固醇质量比对脂质体包封率的影响 固定卵磷脂浓度20 mg/mL、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10:1、吐温80 添加量占卵磷脂质量比20%、PBS 的pH 7.4、超声功率20%、超声时间5 min，考察卵磷脂与胆固醇质量比分别为2:1、3:1、4:1、5:1、6:1 时对脂质体包封率的影响。

1.3.2.2 卵磷脂浓度对脂质体包封率的影响 固定卵磷脂与胆固醇质量比4:1、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10:1、吐温80 添加量占卵磷脂质量比20%、PBS的pH 7.4、超声功率20%、超声时间5 min，考察卵磷脂浓度（在PBS 中的浓度）分别为5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mL、40 mg/mL 时对脂质体包封率的影响。

1.3.2.3 卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比对脂质体包封率的影响 固定卵磷脂浓度20 mg/mL、卵磷脂与胆固醇质量比4:1、吐温80 添加量占卵磷脂质量比20%、PBS 的pH 7.4、超声功率20%、超声时间5 min，考察卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比分别为20:1、10:1、10:2、10:3、10:4 时对脂质体包封率的影响。

1.3.2.4 吐温80 添加量占卵磷脂质量比对脂质体包封率的影响 固定卵磷脂浓度20 mg/mL、卵磷脂与胆固醇质量比4:1、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10:1、PBS 的pH 7.4、超声功率20%、超声时间5 min，考察吐温80 添加量占卵磷脂质量比分别为10%、15%、20%、25%、30%时对脂质体包封率的影响。

1.3.2.5 PBS 的pH 对脂质体包封率的影响 固定卵磷脂浓度20 mg/mL、卵磷脂与胆固醇质量比4:1、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10:1、吐温80 添加量占卵磷脂质量比20%、超声功率20%、超声时间5 min，考察PBS 的pH 分别为6.6，7.0，7.4，7.8，8.2 时对脂质体包封率的影响。

1.3.2.6 超声功率对脂质体包封率的影响 固定卵磷脂浓度20 mg/mL、卵磷脂与胆固醇质量比4:1、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10:1、吐温80 添加量占卵磷脂质量比20%、PBS 的pH 7.4、超声时间5 min，考察超声功率分别为10%、20%、40%、60%、80%时对脂质体包封率的影响。

1.3.2.7 超声时间对脂质体包封率的影响 固定卵磷脂浓度20 mg/mL、卵磷脂与胆固醇质量比4:1、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10:1、吐温80 添加量占卵磷脂质量比20%、PBS 的pH 7.4、超声功率20%，考察超声时间分别为1 min、3 min、5 min、7 min、9 min 时对脂质体包封率的影响。

1.3.3 正交试验 在单因素试验基础上，选取对包封率影响较大的4 因素进行L9（34）4 因素3 水平正交试验方案设计，优化脂质体的制备工艺，试验因素及水平见表1。

表1 L9（34）因素及水平

1.3.4 黄酮含量测定

1.3.4.1 标准曲线绘制 根据文献[13-14]方法，准确称取适量芦丁标准品，用70%乙醇完全溶解，配制质量浓度为1 mg/mL 芦丁标准溶液，采用倍比稀释法制备质量浓度分别为0.500 mg/mL、0.250 mg/mL、0.125 mg/mL、0.063 mg/mL、0.031 mg/mL 的芦丁标准溶液。精密吸取50 μL 芦丁标准溶液，加入5%NaNO2溶液20 μL，静置5 min；加入10% AlCl3溶液20 μL，静置6 min；最后加入4%NaOH 溶液200 μL，静置15 min，在酶标仪中振荡3 s，于510 nm 处测定吸光度。以芦丁质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。

1.3.4.2 含量测定 按照上述1.3.4.1 中方法，自“加入5% NaNO2溶液20 μL，静置5 min”起，到“于510 nm 处测定吸光度”。然后按照公式（1）计算山楂叶总黄酮。

式中:M——山楂叶总黄酮含量，mg/g；C——对应标准曲线计算得出的反应液总黄酮质量浓度，mg/mL；V——反应液体积，mL；W——原料质量，g。

1.3.5 包封率的测定 参照文献[15]方法做适当修改。精密量取脂质体1 mL，加入50 mL 甲醇破乳后再稀释10 倍，于510 nm 处测吸光度，计算黄酮含量（M总）。精密量取脂质体1 mL，4 ℃，10 000 r/min 离心30 min，取上清液10 μL，甲醇定容至5 mL，测定吸光度，计算游离黄酮含量（M游），按照公式（2）计算包封率。

式中:R——包封率，%；M总——黄酮含量，mg/g；M游——为游离黄酮含量，mg/g。

1.3.6 粒径及电位测定 用去离子水将样品稀释适当倍数，采用NanoZS 90 激光粒度仪测定脂质体粒径及Zeta 电位。

1.3.7 透射电镜图像 根据文献[16]方法，用去离子水将样品稀释适当倍数，采用磷钨酸负染法染色观察脂质体形态。

1.3.8 温度对山楂叶总黄酮脂质体贮藏稳定性的影响 将脂质体密封分别在4 ℃、25 ℃条件下避光贮藏28 d，以外观、包封率为指标，评价脂质体贮藏稳定性，外观评价标准如下：（-）表示淡黄色，均一、无絮凝和沉淀；（-+）表示淡黄色，有少量絮凝和沉淀、振荡后溶解；（+)表示黄色，有少量絮凝和沉淀、振荡后溶解；(++)表示黄色，有大量絮凝和沉淀、振荡后不溶解。

1.4 数据分析 实验重复3 次，采用SPSS 25.0 软件进行数据处理，结果以均数±标准差(±s)描述。使用GraphPad Prism 6.02 作图。

2 结果

2.1 单因素考察

2.1.1 卵磷脂与胆固醇质量比对脂质体包封率的影响 结果如图1 所示，在一定范围内，脂质体包封率随着卵磷脂与胆固醇质量比的增加而增大，当比例超过4:1 时，呈下降趋势。因此，卵磷脂与胆固醇质量比在（3:1）～（5:1）范围内较为合适。

图1 卵磷脂与胆固醇质量比对脂质体包封率的影响

2.1.2 卵磷脂浓度对脂质体包封率的影响 由图2 可知，随着卵磷脂浓度的增加，脂质体包封率呈先升后降趋势。当卵磷脂浓度为20 mg/mL 时，包封率最大，然后开始下降。故卵磷脂浓度10～30 mg/mL范围内为宜。

图2 卵磷脂浓度对脂质体包封率的影响

2.1.3 卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比对脂质体包封率的影响 由图3 可以看出，脂质体包封率随着卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比的改变而改变。当质量比为10:2 时，脂质体包封率较高；质量比为10:4 时，脂质体包封率极低。因此，质量比在（10:1）～（10:3）范围内较为适宜。

图3 卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比对脂质体包封率的影响

2.1.4 吐温80 添加量占卵磷脂质量比对脂质体包封率的影响 实验结果见图4，吐温80 添加量占卵磷脂质量比会影响包封率大小。当吐温80 添加量为15%时，包封率最高，之后随着添加量的增加，包封率降低。所以，吐温80 添加量占卵磷脂质量比宜控制在10%～20%范围内。

图4 吐温80 添加量占卵磷脂质量百分比对脂质体包封率的影响

2.1.5 PBS 的pH 对脂质体包封率的影响 图5 结果表明，PBS 的pH 对脂质体包封率的影响较小。当pH 为6.6时，脂质体包封率最高，故选取pH 6.6进行实验。

图5 PBS 的pH 对脂质体包封率的影响

2.1.6 超声功率对脂质体包封率的影响 从图6 可知，超声功率对包封率的影响呈先升后降趋势。当超声功率为60%时，包封率最高，但散热较多，且超声过程中易产生泡沫。因此，综合考虑选择超声功率为40%。

图6 超声功率对脂质体包封率的影响

2.1.7 超声时间对脂质体包封率的影响 由图7 结果可得，超声时间对包封率的影响较小，包封率随着超声时间的增加出现下降趋势。当超声时间为1 min 时包封率最高，故实验选择超声时间为1 min。

图7 超声时间对脂质体包封率的影响

2.2 正交优化试验 由以上结果可知，影响脂质体包封率的因素较多，为优化脂质体的制备工艺，选取影响较大的因素，即卵磷脂与胆固醇质量比（A）、卵磷脂浓度（B）、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比（C）、吐温80 添加量占卵磷脂质量比（D），做4 因素3 水平正交试验。试验方案及结果如表2、表3 所示。

表2 正交试验方案及结果

表3 正交试验方差分析

根据以上结果可知，各因素对包封率影响的先后顺序为：吐温80 添加量占卵磷脂质量比＞卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比＞卵磷脂与胆固醇质量比＞卵磷脂浓度。 通过均值k 分析得出最佳制备条件为A3B3C1D1，即卵磷脂与胆固醇质量比5:1、卵磷脂浓度30 mg/mL、卵磷脂与山楂叶总黄酮质量比10:1、吐温80 添加量占卵磷脂质量比10%。在此条件下制备3 批脂质体，测定包封率分别为71.80%、75.69%、72.25%，平均为（73.25±2.13）%。

2.3 脂质体理化性质初步研究

2.3.1 外观、粒径、电位 根据最佳制备条件，制备山楂叶总黄酮脂质体，由于黄酮类化合物本身特性，脂质体呈淡黄色、均一的液体。粒径如图8 所示，粒径为（132.2±2.85）nm。Zeta 电位如图9 所示，脂质体带负电荷，电位为（-9.29±0.34）mV。

图8 脂质体粒径分布

图9 脂质体Zeta 电位

2.3.2 透射电镜（TEM）图像 图10为脂质体×25 000倍的TEM 图像，可见脂质体为球形或椭球形，表面较光滑，分布均匀。

图10 TEM 图像（×25 000）

2.4 温度对山楂叶总黄酮脂质体的贮藏稳定性的影响

2.4.1 外观 外观变化可直接评价脂质体的稳定性，在4 ℃条件下，脂质体外观无明显变化，无絮凝和沉淀产生。在25 ℃条件下，自14 d 开始出现少量絮凝和溶解，28 d 时颜色发生改变，絮凝和沉淀振荡后溶解。

2.4.2 温度对脂质体包封率的影响 结果如图11 所示，不同贮藏温度可以导致脂质体包封率的改变。随着时间的延长，两种贮藏温度都可导致脂质体包封率下降，在25 ℃条件下，脂质体包封率下降较大，到28 d时，包封率仅为20%左右，而在4 ℃条件下包封率则在40% 以上。由此可见，脂质体在4 ℃条件下贮藏更稳定。

图11 贮藏温度对脂质体包封率的影响

3 讨论

药食同源物质是指某种膳食同时具备药品和食品两种属性，许多保健类的食品都属于该类物质。发挥药食同源作用，不仅可以弘扬中医药文化，促进中药产业多元化，还可以服务于“健康中国”计划[17]。郝晓蓓等[18]采用CiteSpace 对我国近10 年中医食疗研究热点及趋势进行了分析，发现主要集中于中医食疗的临床疗效、药食同源、中西医结合护理和慢性病的防治及推广运用等。由此可见，中医食疗理念已深入人心并应用于许多方面。山楂是一种药食同源物质，山楂果有健胃消食功效，山楂叶的应用相对较少，本研究对其进行利用，避免了有益物质的浪费。脂质体是指活性物质被类脂双分子层包封而形成的闭合囊泡，结构与细胞膜相似[19]，具有靶向性、长效性、生物相容性、低免疫原性等特点。脂质体有多种制备方法，如薄膜分散法、乙醇注入法、逆向蒸发法、复乳法等。薄膜分散法操作简单，耗时短，包封率较高,适用于脂溶性物质的包封，超声可以减小脂质体的粒径。包封率反映药物被载体包封的程度，是脂质体质量评价的一个重要指标，包封率越高，药物被利用的程度越高[20]。张朋[21]通过薄膜分散-超声法制备的鱼油脂质体平均包封率为71.21%；白彩萍等[22]通过该法制备格列本脲类脂质体，包封率为82.50%；而陈玉菲等[23]采用薄膜分散法制备羟基积雪草苷脂质体，包封率仅为（39.30±1.06）%。本研究采用薄膜分散-超声法制备的脂质体包封率为（73.25±2.13）%，处于较高水平，介于张朋[21]和白彩萍等[22]的研究之间，远高于陈玉菲等[23]的研究。该方法简单可行，提高了山楂叶总黄酮的包封率，山楂叶总黄酮的利用程度会有所提高，而包封率有所差异则可能与脂质体包封的药物不同有关。随着贮藏时间的延长，被包封的药物会有所泄露，包封率随之下降，这与脂质体的稳定性有关。本研究将山楂叶总黄酮脂质体分别在4 ℃、25 ℃条件下避光保存28 d，以外观及包封率为指标考察稳定性，结果显示在25 ℃条件下包封率下降较快，该结果与张朋等[21,24]研究结果一致，说明结果具有可靠性，脂质体在4 ℃条件下稳定性较好。

4 小结

本研究采用薄膜分散-超声法将山楂叶总黄酮包封于脂质体中，通过单因素及正交试验得出最佳制备工艺，结果显示在该条件下制备的脂质体具有良好的理化性质，在4 ℃条件下有较好的贮藏稳定性。因此，该制备工艺具有一定的可行性，可为后期开发山楂叶总黄酮中医食疗相关产品提供较好的制剂基础，该制剂能够发挥黄酮类化合物的药理作用，在高血糖、高血脂等人群中有一定的应用前景，但开发食疗产品尚需进行产品配方及动物、临床相关试验的研究。