豆粕添加和发酵时间对甜象草青贮营养品质与细菌多样性的影响

何 秀，徐美余，辛维岗，张棋麟，王 峰，林连兵，*

(1.昆明理工大学 生命科学与技术学院，云南 昆明 650500； 2.云南省高校饲用抗生素替代技术工程研究中心，云南 昆明 650500)

青贮饲料是通过在细碎的青绿植物中添加益生菌进行密封发酵得到的一种能长期保存的饲料。青贮发酵不仅能延长饲料的保存时间，还避免了秸秆焚烧带来的环境污染，青贮后的饲料具有适口性好和营养丰富等特点。随着我国畜牧业的迅速发展，青贮原料也逐渐多样化。近年来，青贮饲料的研究主要集中于青贮的原料、添加剂、微生物发酵和防腐措施等方面。甜象草()是近年来普遍流行使用的饲用牧草，具有低成本高收益的优势，不仅糖分含量高，其汁液也鲜嫩可口。研究表明，用甜象草与猪饲料混合饲喂可使土肥猪肉质风味得到改善。赖大伟等、王玉麒等研究表明，甜象草能促进肉牛的增重，提高奶牛的泌乳量，是饲喂的最佳粗饲料。因此，在养殖畜牧业的发展中甜象草作为优质饲用牧草具有广阔的应用前景。

因甜象草所携带的乳酸菌等有益菌群在发酵初期不占据优势，可能导致饲料腐败变质，加剧营养成分的流失。复合乳酸菌菌剂的添加可增加乳酸菌数量，促进乳酸发酵，降低饲料中的pH值，抑制有害菌群的增长，提高饲料的安全性。乳酸菌的添加能提高青贮料的乳酸含量和消化率，保证青贮料的发酵品质。复合菌剂的添加不仅可以改善青贮品质，还能缩短青贮发酵周期，降低养殖成本。除此之外，甜象草收割后含水量较高，碳水化合物含量少，不宜单独青贮，一般通过添加碾碎的谷物来改善饲料营养和发酵品质，豆粕的蛋白质和氨基酸含量较高，是青贮饲料的常用辅料。因此，本研究以豆粕为氮源补充原料，以期提高青贮发酵品质，从而获得高质量畜禽食品。

青贮饲料的品质由青贮过程中微生物菌群的演绎变化和最终的发酵产物共同决定。目前，有关甜象草青贮发酵饲料的研究较少，主要集中在甜象草的饲喂效果和与其他秸秆原料混合青贮后的发酵品质等方面，关于豆粕的添加和发酵时间对甜象草青贮的相关研究尚未有报道。因此，本研究主要以甜象草为主要原料，在复合菌剂和玉米粉的基础上添加豆粕，以探究豆粕的添加与发酵时间对甜象草青贮饲料的发酵品质和细菌多样性的影响，以期为畜牧养殖业提供优质的甜象草青贮饲料，促进无抗养殖更好发展。

1 材料与方法

1.1 材料与菌株

玉米粉和豆粕购买于云南昆明某农贸市场。所用复合菌剂由唾液乳杆菌、干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、香肠乳杆菌、福莱乳杆菌组成(每种乳酸菌的活菌数均控制在1×10CFU·mL，喷雾干燥后按1∶1∶1∶1∶1配比备用)，菌种均分离于昆明理工大学生命科学与技术学院噬菌体与肠道微生物课题组提供的植物酵素。甜象草由云南省饲用抗生素替代工程研究中心种植基地种植并提供，9月份收割时原料的含水量约80%。

1.2 试验设计

本试验设计以甜象草为发酵原料，参照高晓梅等研究中的组方二，并在此基础上略有改动。两组饲料配方均以100 kg为总量且以80 kg发酵原料(甜象草68 kg、玉米粉10 kg、复合菌粉2 kg)为基础，在此基础上HSL饲料添加20 kg豆粕作为试验组，LSL饲料添加20 kg甜象草作为对照组。甜象草收割后晾晒1 d，将菌粉溶解后喷洒在原料上，充分混匀后分装入青贮袋中，压实后用封口机密封，每组设置3个生物学重复，于室温(约22 ℃)发酵60 d。

1.3 指标测定

1.3.1 感官评定

每10 d采集饲料样品进行感官评定，参照德国农业协会颁布的青贮饲料感官评定标准进行评价。

1.3.2 水分含量与pH值测定

每10 d采集饲料样品。称取10 g放入水分含量测定仪中进行水分含量的测定。另取10 g青贮饲料于200 mL广口三角锥形瓶中，加入90 mL水，于4 ℃冰箱浸泡24 h；用4层纱布过滤后，测定pH值。

1.3.3 养分含量测定

在10、30、60 d采集饲料样品。通过马弗炉-干法灰化法测定粗灰分(Ash)；苯酚-次氯酸钠比色法测定氨态氮(ammonia nitrogen，AN)；凯氏法测定粗蛋白质含量(crude protein，CP)和总氮含量(total nitrogen，TN)；范氏洗涤纤维法测定中性洗涤纤维(neutral detergent fiber，NDF)和酸性洗涤纤维(acid detergent fiber，ADF)含量。

1.3.4 有机酸含量的测定

处理方法参照文献[21]，具体如下：在10、30、60 d取10 g青贮饲料于200 mL广口三角锥形瓶中，加90 mL水，4 ℃冰箱中浸泡24 h，期间摇晃4次以上，取80 mL抽滤的液体，浓缩至20 mL后，置于150 mL碘量瓶中，加入50 mL 12.5%硫酸甲醇溶液，混匀后置入30 ℃，150 r·min恒温摇床中酯化24 h，在3 000×离心5 min。取上清液150 mL，用20 mL二氯甲烷萃取3次，合并萃取液；加入20 mL饱和氯化钠溶液洗涤3次，加入10 g无水硫酸钠静置过夜。滤出硫酸钠，用GC-MS仪器测定有机酸含量。

1.4 微生物多样性分析

1.4.1 DNA的提取与PCR扩增

在10、30、60 d取青贮饲料样品10 g，浸泡在90 mL 0.85% NaCI溶液中，150 r·min振荡2 h后，用4层纱布过滤，5 000×转速下离心20 min，收集菌体沉淀，存放于-20 ℃冰箱，用E.Z.N.A.soil DNA kit试剂盒提取青贮饲料中细菌的总DNA。用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对16S rRNA基因V3-V4可变区进行PCR扩增，扩增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，27个循环；72 ℃ 10 min。反应体系为：5×TransStart FastPfu缓冲液4 μL，2.5 mmol·LdNTPs 2μL，上下游引物各0.8 μL，TransStart FastPfu DNA聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，补足至20 μL。每个样本3个重复。

1.4.2 数据统计

使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit建库，利用Illumina公司的Miseq PE300/NovaSeq PE250平台测序(上海美吉生物医药科技有限公司)。用fastp软件质控后，用FLASH软件拼接；在UPARSE软件中，根据97%的相似度对序列进行operational taxonomic unit (OTU)聚类。

1.5 数据分析

采用SPSS(IBM SPSS 26)软件对LSL饲料和HSL饲料同一指标进行检验，对同一种饲料不同时间点数据进行单因素方差分析，并采用Duncan氏法进行多重比较。微生物相对丰度和物种组成分析采用UPARSE软件在美吉生物平台进行。结果以平均值±标准差表示，以<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 青贮饲料品质

2.1.1 感官评价

两组青贮饲料感官评价结果见表1和图1。HSL饲料随发酵时间的延长，芳香酸味逐渐浓郁，质地愈加松软，色泽偏黄，无腐败现象，发酵60 d时色泽为黄色且具有面包酸香味，饲料品质为优等(22分)；发酵10 d时LSL饲料的色泽为青绿色，与原料接近，发酵60 d时为黄绿色，质地松散，芳香酸香味浓郁，发酵品质优等(20分)。两组饲料发酵30 d时感官评价的等级均达到优良，LSL饲料的总体评价稍低于HSL饲料。

表1 饲料的感官评价

图1 饲料发酵图Fig.1 Fermentation of feeds

2.1.2 水分含量变化

发酵期间，青贮饲料的含水量和pH值随发酵时间的延长而下降，其中含水量在发酵30 d后逐渐稳定(图2)。HSL饲料发酵10 d含水量便从65.19%下降至59.30%，后缓慢下降为57.20%，pH值从5.30逐渐下降至4.08；LSL饲料的含水量在发酵10 d内下降了10.00%，最终下降至57.88%，pH值从5.20下降至4.14。在整个发酵过程中LSL饲料的含水量和pH值均略高于HSL饲料。

图2 饲料发酵过程中含水量和pH值的变化趋势Fig.2 Trends of water content and pH value during feed fermentation

2.1.3 养分含量

由表2可知，发酵过程中HSL饲料中粗蛋白质含量始终高于LSL饲料，发酵30 d后粗蛋白质含量均显著(<0.05)降低，HSL饲料中的NDF和ADF含量低于LSL饲料，两种纤维含量在两组饲料中随发酵时间增加而显著下降(<0.05)；粗灰分含量在两组饲料之间无显著差异。两组饲料随发酵时间增长AN/TN越高，但比值均低于10%，发酵期间HSL饲料中的AN/TN显著低于LSL饲料(<0.05)。

表2 发酵期间5种养分含量变化趋势

2.1.4 有机酸含量

由表3可以看出，发酵10 d饲料中已产生有较多的乳酸和少量乙酸，发酵期间乳酸和乙酸迅速增加后趋于稳定，最终乳酸在HSL饲料中含量较高，乙酸在LSL中的含量较高。两组饲料在发酵30 d后均检测到少量丙酸，含量相差不多。发酵至30 d前无丁酸的存在，而60 d时在两组饲料中都检测到少量的丁酸。

表3 青贮期间有机酸含量的变化

2.2 细菌多样性

2.2.1 饲料中细菌多样性指数分析

如图3所示，饲料青贮过程中，随着样品序列数的增加，检测到的OTU数量的增加量逐渐减小，Shannon稀释曲线逐渐趋于平坦，其覆盖度均达到99%以上(表4)，测序数据合理，其深度基本全面覆盖样品中绝大多数的微生物信息。

图3 饲料样品菌群稀释曲线Fig.3 Flora dilution curve of feed samples

Chao和Ace指数反映群落相对丰度，值越高群落物种丰富度越高。基于Alpha多样性分析(表4)，物种丰度在发酵过程中具有先下降后升高的趋势，HSL饲料的Chao和Ace指数在3个时间段无显著差异(>0.05)。而LSL饲料的Chao和Ace指数在发酵10 d时最大，发酵至30 d时显著减小(<0.05)。两组饲料的Chao和Ace指数均在发酵10 d时有显著(>0.05)差异。LSL饲料的Chao指数只在发酵30 d时低于HSL，在其他相同发酵时间下LSL的Chao和Ace指数都高于HSL。

表4 两组饲料不同发酵时间的Alpha多样性分析

Shannon指数和Simpson指数综合反映群落中物种种类和物种均匀程度，饲料菌群的Shannon指数先降低后升高，Simpson指数逐渐降低。发酵不同时间，Shannon指数在LSL饲料中均有显著差异(<0.05)，在HSL饲料中无显著差异(>0.05)；两组饲料的Shannon和Simpson指数均在发酵10 d时有显著差异(<0.05)，10 d后有所降低。青贮发酵过程中物种多样性下降，且相同发酵时间LSL饲料的物种多样性高于HSL饲料，LSL饲料的物种均匀程度低于HSL饲料。发酵30 d，Alpha多样性指数在两组饲料中无显著差异(>0.05)。

2.2.2 饲料中菌群相似性

根据距离判断样品间的相似度，距离越近，样品间的物种组成相似度越高。由图4可知，HSL和LSL两组饲料整体看来，在10 d时细菌菌群各自聚集且距离较远，群落构成存在一定的差异性，且样品重复性好，群落构成存在一致性(图4-A)。两组饲料单独分析时，在3个时间段之间均存在一定差异，HSL饲料在青贮发酵30 d和60 d的菌群距离较近，具有一定的相似度(图4-B)，而LSL饲料在3个时间段距离较远，差异性较大(图4-C)。当两组饲料单独从10、30、60 d比较时，除30 d时距离较近外，其他两时间点距离较远(图4-D、4-E、4-F)。

A，两组饲料在发酵10、30、60 d的PcoA图；B，HSL饲料发酵10、30、60 d的PcoA图；C，LSL饲料发酵10、30、60 d的PcoA图；D，2组饲料在发酵10 d时的PcoA图；E，2组饲料在发酵30 d时的PcoA图；F，2组饲料在发酵60 d的PcoA图。A， PCoA diagram of two groups of feed fermented for 10 days， 30 days and 60 days； B， PCoA diagram of HSL feed fermentation for 10 days， 30 days and 60 days； C， PCoA diagram of LSL feed fermentation for 10， 30 and 60 days； D， PCoA diagram of two groups of feed at 10 days of fermentation； E， PCoA diagram of two groups of feed at 30 days of fermentation； F， PCoA diagram of two groups of feed at 60 days of fermentation.图4 两组饲料的聚类图Fig.4 PcoA on OTU level diagram of two feed groups

2.2.3 门水平上细菌菌群结构分析

两组饲料基于门水平的微生物菌群结构和丰度比值如图5所示。两组饲料在发酵期间，均以厚壁菌门(Firmicutes)为优势菌门，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteriota)、拟杆菌门(Bacteroidota)和绿弯菌门(Chloroflexi)少量存在。发酵10 d，HSL饲料中厚壁菌门的相对丰度(87.86%)高于LSL饲料(70.05%)，HSL饲料变形菌门的相对丰度(8.583%)低于LSL饲料(17.28%)，HSL饲料中放线菌门相对丰度(2.78%)低于LSL饲料(7.99%)。两组饲料的厚壁菌门相对丰度在30 d均达到最高，LSL饲料(93.94%)略高于HSL饲料(94.90%)，变形菌门和放线菌门相对丰度最低，其中，HSL饲料的变形菌门和放线菌门相对丰度(4.656%、0.85%)高于LSL饲料(4.04%、0.71%)。发酵60 d，厚壁菌门相对丰度略有降低，其他门类均略有升高且低于发酵10 d的相对丰度。两组饲料各自在青贮发酵的30～60 d，各门水平上的物种差异不显著(>0.05)。

图5 门分类水平的细菌群落组成Fig.5 Composition of bacterial community at the phylum level

2.2.4 属水平上细菌菌群结构分析

两组饲料基于属水平微生物菌群结构如图6所示。相对丰度大于1%的属有8个，分别是乳杆菌属()、片球菌属()、魏斯氏属()、肠杆菌属()、链霉菌属()、乳球菌属()、微杆菌属()、纤维菌属()。两组饲料在发酵10 d的优势菌为片球菌属，且在HSL中的相对丰度(49.99%)较LSL饲料(28.12%)高，肠杆菌属的相对丰度在HSL饲料中为6.04%，在LSL饲料中为10.44%。发酵第30天乳酸菌属占据主导地位，在HSL和LSL饲料中的相对丰度分别为88.20%和88.96%，肠杆菌属相对丰度均降低至3.35%和2.95%。发酵60 d，两组饲料中乳杆菌属相对丰度略有降低，其他属类相对丰度均略有增加；其中LSL饲料中乳杆菌属的相对丰度显著降低至77.25%，肠杆菌属相对丰度增加至4.76%。两组饲料各自在发酵的30～60 d，物种间差异均不显著(>0.05)，与门水平结果相同。

图6 基于属水平的微生物群落结构分析Fig.6 Composition of bacterial community at the genus level

3 讨论

3.1 豆粕添加和发酵时间对甜象草青贮感官评价的影响

青贮饲料品质评定最直接快速的方法是考察饲料的颜色、质地和气味等。本试验中的HSL和LSL饲料发酵30 d感官评价等级已达到优良，发酵60 d均处于优等，其中，HSL饲料在色泽和气味上略优于LSL饲料，表明两组饲料在发酵30 d后就可供使用，而豆粕的添加可为青贮发酵饲料的表观品质增色。含水量是饲料青贮成败的关键，青贮饲料含水量在65.00%～70.00%最佳。两组饲料在发酵前含水量均约为65.00%，为饲料的青贮提供了有利的条件。含水量在发酵60 d后均下降至约57.00%，其中前10 d下降明显，30 d后趋于平稳，这可能是乳酸菌的快速增殖消耗了水分。而含水量的降低使细胞中糖分浓缩，更有利于乳酸的发酵，提高饲料品质。除含水量外，pH值是衡量青贮饲料发酵品质的另一指标，优质饲料的pH值应在4.20以下。本试验的两组饲料发酵60 d时pH值下降至4.20以下，而玉米青贮的pH值在第2 d下降到4.00以下，笋壳与稻壳混合发酵至45 d时pH值下降到4.2以下，表明饲料青贮过程中pH值的变化可能与牧草本身的性质有关。发酵60 d，LSL饲料的pH值略低于HSL饲料，表明添加豆粕可能会促进乳酸菌发酵，降低饲料中的pH值，这与感官评价的结果相一致。

3.2 豆粕添加和发酵时间对甜象草青贮营养品质的影响

营养品质是决定青贮饲料价值的关键因子之一，其中粗蛋白质、AN/TN、ADF、NDF和灰分含量是营养品质的重要组成部分。粗蛋白质含量与饲料营养品质呈正比；AN/TN低于10.00%则为优质饲料；NDF和ADF含量越低饲料消化率越高，灰分含量与有机物含量损失的程度呈正比。试验中，发酵60 d时LSL饲料中的AN/TN含量高于HSL饲料和，表明添加豆粕可显著降低AN/TN，提高饲料的营养品质。发酵期间HSL饲料的NDF、ADF和粗灰分含量低于LSL饲料，说明添加豆粕不仅有利于可被吸收的营养成分保存，还能减缓有机物含量的损失。饲料中几组营养成分发酵30 d含量均显著增加，发酵至60 d便略有降低，表明两组饲料发酵30 d最佳。此外，有机酸也是青贮饲料品质的评价指标，其中，乳酸能有效提高饲料品质。两组饲料中的乳酸含量在发酵60 d内均先增加后略下降，说明乳酸菌在发酵期间逐渐占据优势，当发酵到一定程度时，乳酸开始分解为乙酸、丙酸等有机酸，导致乳酸含量增加缓慢。发酵30 d时丙酸出现，无丁酸存在，表明丙酸杆菌在发酵30 d活动较强烈，将部分乳酸分解为丙酸；而在60 d均检测到少量的丁酸，这可能是取样时空气进入导致羧酸菌的生长，由此说明厌氧是青贮的重要条件，也证明了本试验中两组饲料在发酵30 d品质最佳，与营养成分的测定结果相一致。然而，虽然丁酸在青贮饲料中被认为是饲料腐败的标志，但研究表明，丁酸能增强食物风味，因此，丁酸在饲料中存在的标准还有待进一步研究证明。

3.3 豆粕添加和发酵时间对甜象草青贮细菌多样性的影响

青贮饲料是一个多种微生物共同参与的复杂体系，微生物的群落结构也影响着饲料品质和营养成分。从样品稀释曲线可以看出，样本测序量饱和，覆盖了样本中绝大多数细菌物种信息。Alpha多样性指数表明，豆粕的添加影响了微生物的群落结构，能减少饲料中微生物群落结构差异。聚类分析结果表明，两组饲料发酵期间存在一定差异，但总体上发酵30 d后两组饲料的物种组成相似度较高，可能是因为复合菌剂促进了优势菌乳酸菌的生长，使饲料中细菌物种相似度趋于统一化。两组饲料在发酵时期以厚壁菌门和变形菌门为优势菌门，这与大麦和苜蓿青贮时的菌群研究结果一致，厚壁菌门中大多细菌可降解纤维素、蛋白质等大分子化合物，而变形菌门包含多种病原菌。发酵10 d时HSL和LSL饲料的厚壁菌门相对丰度分别为87.86%和70.05%，表明厚壁菌门在发酵10 d时已占据优势，而豆粕的添加能提高厚壁菌门的相对丰度，减少变形菌门(Proteobacteria)在饲料中的相对丰度，降低有害微生物的数量。发酵30 d厚壁菌门和乳酸菌属的相对丰度达到最高，变形菌门和肠杆菌属相对丰度最低，表明两组饲料的最佳青贮发酵时间为30 d，与营养成分和有机酸含量的结果一致。乳酸菌的增殖与变化情况在一定程度上决定着青贮饲料的品质，乳杆菌属()在两组饲料发酵至60 d略有降低，其他菌属略有升高，这可能是由于取样过程中饲料与空气接触从而抑制了乳杆菌的生长，反之促进了其他好氧菌的生长。在发酵的30～60 d，HSL饲料中的厚壁菌门和乳酸菌属降低的相对丰度值明显小于LSL饲料，变形菌门和肠杆菌属增加的相对丰度值小于LSL饲料，表明豆粕添加能在长时间发酵过程中保证乳酸菌属的数量，从而减少其他病原菌在饲料中的占比。

4 结论

添加20%豆粕可提高甜象草青贮饲料的蛋白质含量，降低pH值和氨态氮比值，提高厚壁菌门相对丰度，降低变形菌门相对丰度，有效改善青贮品质。随甜象草发酵时间的延长，含水量有所降低，养分损失增加；但pH值降低，乳杆菌属相对丰度提高，变形菌门和肠杆菌属相对丰度降低，改善了青贮品质。发酵30 d甜象草青贮品质最优。