H9N2亚型AIV NA基因多聚腺苷酸化信号位点对病毒复制的影响

罗钰雯，夏 静，李念灵，李永新，申玉玺，李淑芸，陈 雯，樊顺怡，崔 敏， 黄 勇

(四川农业大学 动物医学院，四川 成都 611130)

H9N2亚型禽流感病毒(H9N2 subtype of Avian influenza virues，H9N2 AIV)于1966年在美国威斯康星州首次被分离，至今蔓延全球，此病毒造成禽类呼吸困难，产蛋量下降。H9N2 AIV致病性较低，但其易与其他病原体混合感染禽类，导致病情加重，从而造成巨大的经济损失。H9N2 AIV在我国广泛流行，在鸡、鸭、鹌鹑、野鸡、鹧鸪、鸽子、白鹭和猪等动物中均已分离到。遗传进化分析表明，在我国鸡群中病毒主要流行亚型为Y280-like，而G1-like亚型仅在鹌鹑等珍禽中流行。此外，H9N2 AIV还可突破物种屏障，造成人的感染。截至2020年，世界卫生组织(WHO)和中国疾病预防控制中心(CDC)共报告50例人感染H9N2的病例，且主要属于Y280-like亚型，所幸暂无人传人的报道。H9N2病毒除了可以从禽直接感染人之外，还可通过猪、宠物狗等其他中间哺乳动物感染人。此外，H9N2 AIV还为H5N1、H1N1、H7N10等AIV亚型提供内部基因。因此，H9N2 AIV成为具有大流行潜力的流感病毒之一。

流感病毒的基因组由8段负链RNA组成，基因组RNA(vRNAs)是病毒mRNA和cRNA在感染细胞中合成的模板。病毒mRNAs是vRNAs的不完全拷贝。在vRNA的3′端启动mRNA合成，以从宿主mRNAs抢夺的10～13个核苷酸的含帽片段作为引物，mRNA合成终止于距vRNA 5′端尿苷残基16个核苷酸的延伸处，最后加入poly(A)尾。研究表明，在甲型AIV RNA 5′端附近的一段尿嘧啶(U)是病毒mRNA合成的多腺苷化位点。在AIV的转录过程中，vRNA5′端末始终与RNA依赖的RNA聚合酶复合体相结合，而vRNA模板则以3′到5′的方向通过聚合酶复合体。由于5′末端存在5～7个碱基U，于是反复拷贝碱基U，从而产生一个poly(A)尾。vRNA模板的5～7个碱基U形成的聚腺苷酸化信号对于病毒基因的转录至关重要。当vRNA模板的5′末端发生突变时，失去与聚合酶的结合作用或导致结合能力减弱时，就会抑制聚腺苷酸化过程。而当vRNA模板的5′端一连串U被替换为A时，就会转录产生带有poly(U)尾巴的mRNA转录本，因此不能由细胞核输出到细胞质中。

本实验室于2014年从四川省德阳市的蛋鸡场分离一株H9N2 AIV，命名为A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2)。该分离株临床上可引起鸡群明显的呼吸困难，剖检可见严重的气管和肺出血，发病率约40%。基因遗传进化分析显示，A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2)属于Y280-like亚型h9.4.2.5分支。对近年来H9N2 AIV分离株的全基因组核苷酸序列分析显示，基因5′端多聚腺苷酸化信号位点处具有多样性，多为5个(U)或6个(U)连续的碱基U，而其他基因则为单一的U结构。因此，本研究以该分离株为骨架，构建H9N2反向遗传操作系统，同时对基因5′端多聚腺苷酸化信号位点5个或6个碱基U是否影响病毒的生物学特性进行了初步的探究。

1 材料与方法

1.1 毒株与载体

A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2)(以下简称CQY-H9N2)AIV由本实验室分离保存；pHW2000质粒购于淼灵质粒平台。

1.2 菌种、细胞与实验动物

TOP10感受态细胞购自上海擎科生物科技有限公司；MDCK细胞由四川省自贡市疾病预防控制中心提供；293T细胞由四川农业大学动物医学院猪病研究中心提供；SPF鸡胚购自北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司。

1.3 主要试剂

PrimeSTAR Max Premix (2×)、Premix(TaKaRaVersion 2.0 plus dye)、5×PrimeScript RT Master Mix、QuickcutⅠ限制性核酸内切酶、TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit均购自TaKaRa公司；Gel&PCR Clean Up Kit购自OMEGA公司；SE无缝克隆和组装试剂盒购自北京庄盟国际生物基因科技有限公司；质粒小提试剂盒、无内毒素质粒小提中量试剂盒购自TIANGEN公司；FBS胎牛血清购自PAN公司；脂质体转染试剂盒Lipofectamine3000 Reagent Protocol购自ThermoFisher公司。

1.4 病毒的扩繁

将本实验室保存的CQY-H9N2株稀释1 000倍，采用绒毛尿囊腔接种法接种于9～10日龄的SPF鸡胚。弃去24 h内死亡鸡胚，连续培养72 h后无菌收集绒毛尿囊液，并按照已建立的检测方法对尿囊液进行病毒检测。

1.5 病毒RNA的提取及目的片段的扩增

病毒RNA的提取方法按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit试剂盒说明书进行，从200 μL阳性尿囊液中抽提病毒的总RNA后立即沸水浴3 min，冰水浴2 min，随后进行反转录。反转录体系为RNA 5 μL，5 × PrimeScript RT Master Mix 4 μL，ddHO补足至20 μL。反应程序为37 ℃ 15 min，85 ℃ 15 s。以此 cDNA 为模板，使用PrimeSTAR Max Premix高保真酶和表1中的克隆引物分别扩增CQY-H9N2的8个片段：2、1、、、、、、，目的片段纯化回收后，由生工生物工程(上海)股份有限公司成都分公司进行测序，序列信息上传至GenBank数据库，登录号：MW493190-MW493196、MW493229。

1.6 重组质粒的构建

为减少克隆步骤，以及避免目的片段中IIs型内切酶位点B I和I的沉默突变，本研究采用同源重组的方法将CQY-H9N2的八段基因分别克隆入pHW2000质粒中。质粒采用PCR扩增的方式线性化，质粒扩增引物为pHW2000F：CCCCCCCAACTTCGGAGGTC和pHW2000R：AATAACCCGGCGGCCCAAAA。使用SE无缝克隆和组装试剂盒将回收的线性化质粒和1.5节中获得的目的片段进行同源重组，载体与目的片段的摩尔比为1∶(2～4)，37 ℃连接30 min后将重组子转化至 TOP10 感受态细胞，37 ℃培养20 h后进行菌落PCR鉴定。菌落PCR阳性菌置于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中进行扩大培养，采用无内毒素质粒提取试剂盒抽提质粒，单酶切鉴定无误后将质粒送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，每个片段测3个样本，选取无突变的质粒保存备用(表1)。

表1 同源重组法构建重组质粒的引物

1.7 细胞转染与病毒拯救

将293T细胞培养于12孔细胞培养板中，待细胞长至85%～90%时进行转染。转染步骤按照Lipofectamine3000 Reagent Protocol说明书进行，具体如下：取2个无菌的EP管，编号为A和B。A管中加入1.87 μL Lipofectamine3000 Reagent和62.5 μL opti-MEM培养基，静置5 min；B管中加入8个重组质粒(每种质粒200 ng)和5 μL Lipofectamine3000和62.5 μL opti-MEM培养基。将A和B管混合后室温静置孵育15 min。用预热的opti-MEM培养基清洗细胞2～3次，将AB混合液加入至细胞中，于37 ℃、5% CO的细胞培养箱中孵育1 h，加入1 mL opti-MEM培养基培养24～36 h。收集细胞和上清液，反复冻融3次后离心，将上清接种于密度为90%的MDCK细胞中，培养6 h后加入终浓度为2 μg·mL的TPCK-Trypsin，继续培养72 h，收集细胞和上清液连续盲传3代后，收集细胞上清进行血凝试验和RT-PCR检测。拯救成功的病毒分别命名为rCQYU-H9N2与rCQYU-H9N2。

1.8 病毒的基因组测序

将拯救的CQY-H9N2毒株进行基因组序列测定，以确定病毒在拯救过程中是否发生突变。具体操作方法参考1.5节进行。

1.9 EID50、TCID50和MOI的测定

rCQY-H9N2毒株与亲本毒株的TCID和EID的测定参照Reed-Muench法进行。

1.10 生长曲线的比较

将 MDCK 细胞接种于6孔细胞培养板中，待细胞形成单层后用预热的opti-MEM培养基清洗3次，将病毒以10TCID的剂量接种于6孔板中，放入细胞培养箱中吸附1 h，用 PBS 清洗3次后加入2 μg·mLTPCK-Trypsin opti-MEM培养基继续培养。以10EID的病毒剂量接种10日龄SPF鸡胚，在37 ℃下孵育。分别在接种MDCK和鸡胚后2 、4 、6 、12 、24 、36 、48 、72 h 收取细胞上清或绒毛尿囊液，进行荧光定量测定其核酸拷贝数，然后绘制病毒的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 目的片段的PCR扩增结果

提取病毒的总RNA，反转录获得病毒的cDNA，然后通过聚合酶链式反应扩增目的基因片段。结果显示，通过RT-PCR扩增出的2、1、、、、、、目的片段的大小与目标序列是相同的(图1)。

M1， DL2000 DNA Marker； M2， DL5000 DNA Marker； NS～PB2，引物NS～PB2的PCR扩增产物。M1， DL2000 DNA Marker； M2， DL5000 DNA Marker； NS-PB2，PCR products of primer NS-PB2.图1 A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2) 毒株全基因RT-PCR结果Fig.1 A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014(H9N2) strain whole-genome RT-PCR result

2.2 构建重组质粒及拯救病毒

将纯化的目的片段与pHW2000载体同源重组后，转化至TOP10感受态细胞中。提取质粒并测序，通过序列比对可知，本研究构建的8个质粒核苷酸序列均无突变。通过脂质体转染的方法将这8个重组质粒转染293T细胞后并在MDCK上盲传3代，细胞出现变圆、脱落，形成空斑病变(图2)，成功获得拯救病毒rCQYU-H9N2与rCQYU-H9N2。

A，正常 MDCK 细胞；B，接种500 μL 的rCQYU5-H9N2在48 h MDCK 细胞 CPE；C，接种500 μL 的rCQYU6-H9N2在48 h MDCK 细胞 CPE；D，接种500 μL 的CQY-H9N2 在48 h MDCK细胞CPE。A， Normal MDCK cells； B， MDCK cells were inoculated with 500 μL rCQYU5-H9N2 influenza virus CPE at 48 h； C， MDCK cells were inoculated with 500 μL rCQYU6-H9N2 influenza virus CPE at 48 h；D， MDCK cells were inoculated with 500 μL CQY-H9N2 influenza virus CPE at 48 h.图2 rCQY-H9N2在 MDCK 细胞培养中的细胞病变Fig.2 Cytopathy of rCQY-H9N2 in MDCK cell culture

2.3 rCQY-H9N2 毒株的鉴定和其与亲本毒株血凝效价 、EID50和TCID50 的测定

rCQYU-H9N2毒株的血凝效价、EID和TCID滴度与亲本毒株无明显差异，但高于rCQYU-H9N2株(表2)。

表2 病毒生物学特性

2.4 rCQY-H9N2 毒株与亲本病毒在MDCK和鸡胚上生长曲线比较

rCQY-H9N2 (rCQYU-H9N2和rCQYU-H9N2)与亲本毒株在鸡胚和MDCK上均可高效复制，其生长曲线无显著性差异，结果见图3。

A， 病毒在MDCK细胞中的生长曲线；B，病毒在鸡胚中的生长曲线。拷贝数以单位体积(1 μL)核酸拷贝数量的指数对数值表示。A，Growth curves of virus on MDCK cells； B， Growth curves of virus on chicken embryo. Copy number was expressed as the logarithm of the number of nucleic acid copies per unit volume (1 μL).图3 病毒在鸡胚和MDCK细胞中的生长曲线Fig.3 Growth curves of virus on chicken embryo and MDCK cells

3 讨论

在克隆过程中，由于流感病毒为分段RNA病毒，经典方法采用B Ⅰ双酶切线性化质粒与目的片段。但是由于B Ⅰ酶切效率较低且该质粒需要进行双酶切，因此尽管延长酶切时间，增大酶量，仍然会有环状质粒存在，且酶切后由于黏性末端的存在，线性质粒易产生自连，这使得克隆过程中假阳性率高，严重干扰试验结果。此外，由于多数流感病毒基因组含有II型酶切位点B Ⅰ和Ⅰ，因此，较多研究采用沉默突变方法改变基因组序列，耗时耗力。本试验采用PCR扩增线性化质粒和同源重组克隆，在一定程度上减少了质粒自连以及酶切效率低的问题，阳性克隆效率为50%～90%。转染细胞选择方面，大多文献使用293T细胞与MDCK细胞混合培养进行转染，本试验发现，二者混合培养，MDCK细胞对293T细胞的生长具有抑制作用，293T细胞活性差，从而无法达到转染条件。因此，本试验仅采用293T细胞进行转染，且在293T细胞培养期间不添加经典方法中的TPCK-Trypsin，以确保293T细胞的活性。

我们成功构建出A/Chicken/China/Sichuan/CQY/2014反向遗传操作平台，并利用该平台初步探究了基因5′末端多聚腺苷酸化信号位置连续的U与U对病毒生物学特性的影响。研究结果表明，H9N2 AIV基因5′末端多聚腺苷酸化信号连续的U或U对病毒的转染没有影响，这与Li等的研究结果相同。而HA、EID与TCID结果显示的rCQYU-H9N2滴度低于rCQYU-H9N2与亲本毒株，与Li等的研究结果略有差异。

流感病毒的vRNA是转录产生mRNA和复制产生cRNA并最终合成子代病毒vRNA的模板。从vRNA模板5′端开始到多聚腺苷酸化信号位点有16个碱基(16 nt)，与3′末端互补配对形成柄状结构，研究表明这16个碱基至关重要，寡核苷酸(U)群仅向5′端迁移一位(16 nt → 15 nt)可显著降低多聚腺苷酸化水平。在准确合成cRNA的过程中，流感病毒RNA聚合酶必须在复制时选择忽略多聚腺苷酸化信号。在Li等的研究中，vRNA 5′端多聚腺苷酸化信号位点U转录生成的mRNA比U多出13%，因此，我们推测，流感病毒的vRNA模板5′端多聚腺苷酸化信号位点U的个数越多，复制时RNA聚合酶反复拷贝vRNA的U段错误合成poly(A)的几率越大。在某些情况下，病毒RNA聚合酶在合成cRNA时可能做出了错误的选择，从而导致在U段停止复制。这种情况可能发生的比较频繁，在大多数情况下，RNA聚合酶的错误合成poly(A)将形成无功能的cRNA模板，而这种cRNA模板无法合成子代病毒的vRNA，从而导致病毒滴度降低。