耳念珠菌实验室鉴定方法的研究进展

邹玉 陈宗耀 鄂建飞 郑茂

(1.四川省德阳市人民医院输血科，德阳 618000；2.四川省德阳市人民医院检验科，德阳 618000)

耳念珠菌(Candidaauris)可导致人体严重的侵袭性感染，自2009年日本首次报道以来，全球呈快速流行趋势，甚至暴发多次院内感染[1-3]。按照美国疾病预防控制中心(Centers for Disease Control and Prevention,CDC)暂定的耳念珠菌耐药折点(氟康唑MIC≥32 mg/L、两性霉素B MIC≥2 mg/L、卡泊芬净MIC≥2 mg/L)，临床分离的耳念珠菌对这3类常用抗真菌药物往往表现出耐药，甚至泛耐药，故可选择的治疗方案非常有限[4]。近十年来耳念珠菌感染病例呈指数级增长，遍布全球六大洲40多个国家和地区，涉及5个不同的地理进化分支[5]。新冠病毒全球大流行也为耳念珠菌传播提供了条件，新冠肺炎危重患者更易并发耳念珠菌感染，预后差，死亡率高[6-7]。可见，耳念珠菌俨然成为一个全球公共卫生的新威胁。

实验室传统的形态及生化表型方法，无法识别耳念珠菌或误将其鉴定为其他念珠菌，可能低估了实际的临床感染率[8]。2018年，Wang等[9]报道中国首例耳念珠菌，该菌株分离自一名老年患者的支气管肺泡灌洗液。同年，沈阳和北京地区分别进行的两项回顾性研究，重新确认出17株耳念珠菌，所有菌株对氟康唑耐药，原始鉴定均被误判为希木龙念珠菌(Candidahaemulonii)[10-11]。2021年，中国医科大学尚红院士团队[12]报道一项为期3年的耳念珠菌流行病学监测，单从沈阳某综合医院就分离出耳念珠菌93株；复旦大学黄广华教授团队[13]研究证实，仅北京地区就至少存在两个不同的耳念珠菌分支。为了加强对耳念珠菌感染的重视，中华医学会组织专家组发布《成人耳念珠菌感染诊治防控专家共识》，旨在助力解决其感染诊治及防控的难题[14]。面对耳念珠菌难识别、难鉴定的困境，本文就其实验室鉴定方法作如下综述。

1 表型水平鉴定

1.1 形态及培养特征

耳念珠菌是一种以出芽方式繁殖的酵母类真菌，几乎不形成假菌丝或芽管，也不产生厚壁孢子；镜下形态无特征性提示，通常为单个或成双的卵圆形孢子；可以常规生长在沙堡弱培养基，菌落呈黏性、奶油状、灰白色，边缘光滑，但筛选原始样本的培养时间可能长达10 d[15]。临床分离的耳念珠菌常具有多种菌落形态，如酵母状、丝状、细长状等，但研究表明丝状生长是其普遍特征，这很可能与其耐药及毒力有关[16]。

与大部分念珠菌不同，耳念珠菌具有较强耐高温、高盐特性，在42℃含有100 g/L氯化钠的培养基中生长良好(希木龙念珠菌42℃不生长)，基于该特性，美国CDC推荐采用高温高盐富集培养的方法从混合样本中分离耳念珠菌[17]。Das等[18]报道将12.5%氯化钠和9 mmol/L硫酸亚铁添加至酵母浸出粉葡萄糖琼脂制成一种新型培养基，耳念珠菌仅需42℃培养48 h即可生长良好，而非酵母菌不生长。另外，Ibrahim等[19]报道将20 g/L甘露醇等添加至改良的沙堡弱培养基，能够培养出低至10 CFU/mL的耳念珠菌临床样本，且对所有分支均具有选择性，特异性达到100%。基于培养的方法是当前临床实验室真菌鉴定的中坚力量，而特殊真菌培养基便是一种选择性分离耳念珠菌的快速方式。

1.2 显色琼脂

显色琼脂是一种利用微生物自身代谢产生的酶与相应底物反应显色来鉴别微生物的培养基，其反应的灵敏度和特异性均明显优于传统培养基。耳念珠菌在科玛嘉显色琼脂上生长呈粉红色或米黄色，培养第4天可变为浅粉红色至红色或紫色。由于菌落颜色多样、无特征性，仅凭肉眼难以准确区分，不能将显色琼脂用于耳念珠菌的最终鉴定，但能突出显示可疑菌落。对于最易与耳念珠菌混淆的希木龙念珠菌，可以利用添加苯丙氨酸解氨酶的科玛嘉显色琼脂进行简单有效鉴别[20]。在这种改良的显色琼脂上，耳念珠菌37℃或42℃培养24 h、48 h，均融合生长，呈白色至乳白色的光滑菌落，不产生假菌丝；但希木龙念珠菌37℃培养24 h生长平整，呈淡粉色菌落，培养48 h产生假菌丝，且42℃不生长，从而实现二者的快速、低成本鉴别。

为了提高耳念珠菌识别率，新型显色琼脂陆续被研发出来，如科玛嘉念珠菌显色琼脂，其对耳念珠菌分支的涵盖率达到100%[21]。Borman等[22]报道耳念珠菌在这种新型显色琼脂上呈淡奶白色，带有独特蓝色光晕并扩散到周围琼脂，与之平行培养的50多种念珠菌及相关属，只有临床非常罕见的酵母菌(Candidadiddensiae)呈相似外观，并且耳念珠菌生长速度及菌落数均比在沙堡弱培养基上有明显提高。Bayona等[23]还发现耳念珠菌在该显色琼脂上培养36 h即可出现特定颜色(浅蓝色和蓝色光晕)，凭借此特征可以推测耳念珠菌，以缩短筛选时间。因此，科马嘉念珠菌显色琼脂可以替代传统真菌培养基，快速筛选耳念珠菌，该方法在患者有多种念珠菌混合定植时优势更加明显。

1.3 生化反应

不同微生物所具有的酶系统不尽相同，对底物的分解能力各异，代谢产物亦不同。生化反应是通过检测微生物对各种底物的代谢作用及其代谢产物，实现区别不同的种属，是近代微生物学鉴定的基础。目前，市面上主流的全自动微生物生化鉴定仪大都配备相应的酵母菌鉴定卡，但这些鉴定系统却极易将耳念珠菌错判为其他类型真菌。美国CDC总结了可能出现的误判情况，如表1所示，并建议如果出现表中所列的鉴定结果或无法鉴定时，应进一步采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS)或聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)等方法重新鉴定。

表1 常用酵母菌鉴定系统可能将耳念珠菌误判的情况[24]

生化鉴定系统非常依赖于数据库更新，Vitek2系统就在其升级版(8.01版)中纳入了耳念珠菌。一项来自新加坡的研究显示[25]，Vitek2系统(8.01版)能够正确识别大多数南亚分支，但对东亚分支、南美分支的识别能力有限，若系统报告得分良好则可确认为耳念珠菌。另一项来自加拿大的多中心评价研究显示[26]，Vitek2系统(8.01版)能够以较高可信度正确鉴定出52%的耳念珠菌，但务必注意该版本鉴定出的希木龙念珠菌、C.duobuhaemulonii，仍需进一步判断是否为耳念珠菌。

2 蛋白水平鉴定

MALDI-TOF MS是一种新兴的软电离生物质谱技术，通过激光照射微生物样本与基质形成的共结晶薄膜，样本与基质发生电荷转移使样本分子电离，离子在电场作用下加速进入检测器进行质荷比分析，最终得到以离子质荷比为横坐标、离子峰为纵坐标的特异性蛋白指纹图谱。MALDI-TOF MS具有高灵敏度、高准确性、高通量等特点，为临床微生物领域提供了一种强有力的蛋白质水平鉴定手段。

由于MALDI-TOF MS是基于样本的生成光谱与参考数据库比对，故仅在数据库包含耳念珠菌时方可起到鉴定作用，如德国布鲁克公司的Biotyper系统、法国梅里埃公司的Vitek MS系统。Kwon等[27]报道使用Biotyper和Vitek MS的仅供研究(research use only，RUO)数据库鉴定耳念珠菌，准确率分别为83.6%、93.4%；若使用Vitek MS的体外诊断数据库，准确率还可提升至96.7%。Vatanshenassan等[28]报道采用更新数据库后MALDI-TOF MS，可以快速鉴定沙堡弱培养基和血培养瓶中的耳念珠菌，平均鉴定得分≥ 2，准确率100%；倘若数据库没有涵盖所有分支，则鉴定得分可能<2。由此可见，数据库更新是MALDI-TOF MS识别耳念珠菌的关键，目前MicrobeNet在线数据库已纳入耳念珠菌光谱，免费用于布鲁克数据库的补充。

临床微生物实验室常使用直接点靶而不是全管萃取的方法分离蛋白质，但使用布鲁克质谱仪必须注意到，直接点靶的方案可能造成无法识别耳念珠菌，需要采用全管萃取法才能顺利鉴定[8]。为了提高布鲁克Biotyper系统的识别率，Bao等[29]开发出一套新型CMdb数据库，其对耳念珠菌识别准确率可达到100%，平均鉴定得分2.5。尽管MALDI-TOF MS具有无法比拟的优点，但该技术需要培养分纯菌株，前期过程耗时较长，还需配备价格不菲的质谱仪和涵盖所有分支的数据库，目前尚未成为一种普及的耳念珠菌鉴定方法。

3 基因水平鉴定

3.1 PCR检测

PCR是一种利用特定DNA片段为模板，在DNA聚合酶、核苷酸底物、特异性引物共同参与下，以变性、退火、延伸等步骤，体外扩增DNA片段的分子生物学技术。通常采用耳念珠菌的28s rDNA的D1/D2区域或内转录间隔区(internal transcribed spacer，ITS)作为PCR引物的目标靶位，将扩增后的序列与GenBank数据库中耳念珠菌任一分支基因序列比对，若一致性超过98%，可初步考虑为同一种属。

临床致病的念珠菌大都包含一些独特的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol，GPI)蛋白，这些蛋白在其他物种或谱系中缺乏同源性，可以作为一种遗传标记。Ruiz-Gaitán等[30]报道利用GPI蛋白编码基因，选取与其他物种序列不具有同源性的耳念珠菌特异性引物，可以实现可靠的菌株鉴定。该方法利用氢氧化钠快速裂解单个菌落，通过PCR生成一个或多个小扩增子，随后进行琼脂糖凝胶电泳，总用时不到2 h即可获得模板DNA。该团队还设计了基于GPI蛋白编码基因的多重PCR(multiplex PCR)，可以准确、快速区分耳念珠菌与其近缘物种，使鉴定效率进一步提升[31]。

目前文献已报道多种PCR扩增技术用于耳念珠菌鉴定，包括常规PCR(reverse transcription PCR)[32-33]、多重PCR(multiplex PCR)[34]、实时荧光定量PCR(real-time PCR)[35-41]、单管经典PCR(single-tube classical PCR)[42]、干粉式单剂量PCR(dried single-dose PCR)[43]、环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication，LAMP)[44]等。其中应用最广泛的当属实时荧光定量PCR，其根据融解曲线温度的差异可以从相似念珠菌中特异性识别耳念珠菌，不仅能检测纯培养菌株，亦能检测临床采集的原始样本，如拭子、血液、尿液等[38,41,45-46]。Arastehfar等[47]还设计出首个通过动物模型验证的四重终点PCR(tetraplex PCR)，这种新颖PCR具有成本低、特异性高等优势，但尚无法量化宿主体内的真菌载量。笔者将近年来文献报道用于耳念珠菌鉴定的多种PCR方法进行总结，如表2所示。不难看出，尽管采用不同探针、不同基因靶位的PCR，在鉴定耳念珠菌灵敏度、特异度、检出限等方面略有差异，但其检测性能已满足实验室诊断的常规要求。其中一些PCR方案还成功应用于自动化检测系统(如BD Max平台)[37-38]。此外，布鲁克等公司还研发出耳念珠菌特异性PCR试剂盒，在较低DNA浓度下也能顺利完成鉴定[48]。虽然PCR操作过程相对繁琐，但可以直接检测患者样本的耳念珠菌DNA，而不依赖于真菌培养，极大地缩短实验室鉴定周期并提高诊断敏感性，这一优势是基于培养的其他方法无法媲美的。

表2 文献报道用于耳念珠菌鉴定的多种PCR方法总结

3.2 全基因组测序

全基因组测序(whole genome sequencing，WGS)是利用高通量测序平台检测并排列物种整个基因组碱基序列，几乎能够识别出基因组中任何类型的突变，成为分辨率最高的病原体溯源技术，亦是菌株鉴定的参考方法。WGS发展已日趋成熟，现阶段主流有二代测序技术(high-throughput sequencing，高通量测序)和三代测序技术(single molecule sequencing，单分子测序)。

近年来分离自全球不同地域的耳念珠菌，WGS揭示了其生物学特性和基因组特点明显不同，存在四大分支(南亚、东亚、南非、南美)和伊朗分支，这说明耳念珠菌具有多个独立起源[50]。Chow等[51]采用WGS追溯耳念珠菌的进化史，证实四大分支在全球持续存在，其中东亚分支耐药率最高。Muoz等[52]基于WGS的研究表明，耳念珠菌同一分支之间遗传多样性较低，单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)一般小于100，而不同分支之间遗传多样性明显，SNP一般大于10000。WGS还常作为耳念珠菌暴发的流行病学调查手段，以便快速分析传播链和追踪传播源头。实际工作中，由于某些耳念珠菌分支异常低的多样性，难以建立一个具体SNP临界值来区分来自医院暴发和流行地区的环境分离株，但医院暴发的分离株与基因组高度相关，SNP差异常小于3[53]。

其他基因测序技术也被用于耳念珠菌暴发的调查，如英国牛津纳米孔技术公司生产的便携式MinION测序仪。2016年，英国一家心胸专科医院暴发大规模耳念珠菌疫情，研究者使用MinION测序仪很快溯源出菌株归于印度/巴基斯坦分支，证实疫情起源于亚洲[54]。尽管WGS可以明确菌株起源，在分析菌株间的相关性和医院感染的传播链方面具有优越性，但其作为鉴定手段，尚不够简洁、快速；另一方面，WGS要求操作者具备丰富的生物信息学知识，测试成本相对昂贵，目前不适用于耳念珠菌的常规鉴定。

4 其他方面

生物传感器是利用生物化学和电化学反应原理，将生物化学反应信号通过信号转换器变为光电信号的检测器，为医学研究和临床诊断提供了一种简便快速的新思路。Pla等[55]报道一种基于寡核苷酸门控纳米材料的生物传感器，通过筛选GPI蛋白编码基因中的寡核苷酸，获得耳念珠菌的种属特异性序列，实现准确识别临床样本(如血液)中的耳念珠菌。这种荧光纳米传感器无需对样本进行预处理或DNA扩增，在1 h内即可获得结果，检测限低至6 CFU/mL。Guedes等[56]报道一种可重复使用的新型电化学基因传感器，使用茚三酮作为DNA杂交指示剂，通过微分脉冲伏安法和电化学阻抗谱法能够灵敏地检出尿液中耳念珠菌DNA，并在长达80 d的储存期间仍保持100%响应。与大多数分析技术相比，生物传感器具有成本低、耗时短、体积小、操作简便等优点，在临床样本的耳念珠菌快速鉴定方面显现出巨大潜力，提供即时诊断(point-of-care testing，POCT)的可能性。

T2 Biosystems公司为内置的T2磁共振(T2MR)平台开发了一种用于耳念珠菌诊断的新方法，该技术使用与超顺磁性粒子链接的特异性目标探针，识别并放大病原体相关信号，进而被磁共振检测到。Sexton等[57]报道利用T2MR系统可以快速检测临床皮肤拭子的耳念珠菌，检测限低至5 CFU/mL，耗时仅4～8 h，该方法的灵敏度、特异度、阳性预测值和阴性预测值分别达到89%、98%、98%、89%。T2MR系统操作简便、高效，有望成为一种鉴定皮肤拭子耳念珠菌的候选方法。

5 结 语

耳念珠菌是一种难以识别和治疗的真菌病原体，尽管对其流行病学及致病机制已有一些初步了解，但仍必须时刻避免暴发疫情，而快速、准确的菌株鉴定是重要前提。鉴于传统酵母菌生化鉴定系统的缺陷，选择高性能的鉴定方法十分必要。念珠菌显色琼脂简单易用，也不需要专业的真菌学知识，可作为一种不错的筛选方案。研究者可采用更新数据库的MALDI-TOF MS准确鉴定耳念珠菌，而尚未配备质谱仪的实验室，也可采用基于DNA的PCR方法，各种PCR优点各异，灵敏度、特异度、适用样本类型亦不同，研究者应根据实际检测需求来选择。虽然WGS不是耳念珠菌的常规鉴定方式，但仍是其菌种水平的参考鉴定方法，更是疫情暴发时不可或缺的流行病学分析手段。随着耳念珠菌在世界范围内继续蔓延，相信科研工作者会研发出更多便捷、特异的鉴定技术和更有效的抗真菌药物，为临床提供及时的病原学证据和治疗策略，早日遏制耳念珠菌传播。