五种脱落酸功能类似物对提高小麦抗盐胁迫的效应和机理

刘贯园, 李晓斌, 肖玉梅, 车传亮, 汤显军,丁珊珊, 徐彦军, 覃兆海

(中国农业大学 理学院 应用化学系，北京 100193)

土壤盐渍化是农业发展面临的强大阻力。小麦中度耐盐，其在种子发芽和幼苗生长时期最容易受到盐分影响[1]。研究表明，在盐碱地种植小麦，可导致减产60%以上[2]。因此，如何提高小麦耐盐能力是农业生产中的研究热点。外源应用植物激素是一种应对盐胁迫的实用方法[3-5]。

脱落酸(abscisic acid，ABA)是一种倍半萜类天然植物激素，在植物体应对多种生物和非生物胁迫中发挥着重要的生理诱导作用[6-10]，但存在结构稳定性差和价格高等缺陷，致使其实际应用严重受限，而开发活性更高、稳定性更好的ABA 功能类似物有望解决这一问题。Quinabctin (QB,AM1)是Okamoto 等[11]和Cao 等[12]分别独立筛选出的一种结构稳定的磺酰胺类化合物，具有类ABA 生物活性，可提高多种作物抗旱能力。段留生等[13]设计合成了一系列萘磺酰胺类的ABA 功能类似物，部分化合物具有较好的抑制种子萌发活性。为了提高QB 与ABA 受体亲和性，Cao 等[14]开发了QB 的四氟代产物tetrafluoroquinabctin(TFQB)，其不仅具有更高的抑制种子萌发和促进气孔关闭的活性，还能更持久地提高作物的抗旱能力，同时对延缓蔬菜在储藏过程中的水分流失具有很好的效果[15]。本课题组长期致力于高活性和高稳定性的ABA 功能类似物的创制研究，并于2017 年开发了萘酮戊酸 ((natenpac，以下简称NA)[16]。NA 在抑制种子萌发和幼苗生长，以及提高作物抗旱性方面活性优于ABA，最近研究又发现，NA 还可显著促进葡萄着色并提升品质[17]。2019 年，本课题组基于pyrabactin 和NA 结构，采用类同法设计并合成了一类新型磺酰胺类ABA功能类似物，该类化合物对种子萌发具有高抑制活性[18]。此外，本课题组还开发了QB 类似物indabactin (IQB)和TFQB 的硫代产物 (TFTQB)[19](图式1)。本研究以ABA 为对照，研究QB、TFQB、NA、IQB 和TFTQB这5 种ABA 功能类似物对小麦幼苗的抗盐作用，以期促进ABA 功能类似物在农业生产中的应用。

图式1 脱落酸及其5 种功能类似物的结构式Scheme 1 Structural formula of abscisic acid and its five functional analogues

1 材料与方法

1.1 仪器设备、药剂及材料

EXPRESSIONTM 1680 型根系扫描仪 (精工爱普生公司)；LI-6400 型便携式光合仪 (美国Li-COR 公司)；PAM-2100 型便携式荧光仪 (德国WALZ 公司)；PowerWave XS2 酶标仪 (美国Biotek 仪器有限公司)；DDS—307A 电导率仪 (上海仪电科学仪器科学仪器公司)； 722 可见分光光度计 (上海精密仪器仪表公司)；人工气候培养箱(宁波江南仪器厂)。

供试药剂：脱落酸(ABA) (Sigma 公司)，quinabctin (QB)、tetrafluoroquinabctin(TFQB)、萘酮戊酸 (natenpac，NA)、indabactin (IQB) 和TFQB 的硫代产物TFTQB 均由本课题组合成[16,19]。将供试药剂分别溶于二甲基亚砜 (DMSO) 中，配制成0.01mol/L 的母液，使用时用含吐温-80 的蒸馏水溶液稀释至所需浓度。二甲亚砜 (DMSO) 和吐温-80 在最终溶液中的质量分数控制在0.1%以下。

供试小麦品种为“鲁原502” (中国农业科学院作物研究所)。

1.2 试验方法

1.2.1 小麦幼苗培养和药剂处理 选取大小一致、均匀饱满的小麦种子，室温下用70%乙醇灭菌后用蒸馏水浸泡6 h，转移到育苗盆中催芽。挑选露芽一致的小麦种子放入育苗盆中，加入适量的1/2 Hoagland 营养液，于人工气候培养箱中培养。培养条件为：相对湿度50%，26 ℃，全黑暗。48 h 后培养条件改为：26 ℃，14 h 光照；19 ℃，10 h 黑暗。小麦幼苗长至两叶一心时，分别喷施8 mL 10 μmol/L 的 ABA、 QB、TFQB、NA、IQB 和TFTQB 溶液，2 d 后再喷施一次。然后加入氯化钠 (NaCl)，使其终浓度为300 mmol/L。设置不加药剂及NaCl 处理的空白对照 (CK)，同时设置不加药剂而只加300 mmol/L NaCl 处理的对照 (SCK)，以单独考察盐胁迫对小麦幼苗生长的影响。文中如无特殊说明，所有处理均重复3 次，每次均为18 颗幼苗，试验结果取平均值。

1.2.2 幼苗生物量测定 盐胁迫处理8 d 后取样，分别称量地上部和根部质量，记为鲜重。然后将测过鲜重的小麦样品地上部和根部分别放入烘箱中，于105 ℃下烘干15 min，再降低烘箱的温度至80 ℃，在此温度下将样品烘干至质量不再改变后，测干重。

1.2.3 幼苗叶片相对含水量测定 盐胁迫处理8 d后取样，每处理取4 片小麦叶，参照文献方法[20]测定叶片的相对含水量。

1.2.4 幼苗根系生长指标的测定 盐胁迫处理8 d后取样，用根系扫描仪测定小麦幼苗根长、根表面积和根体积。每处理重复8 次，结果取平均值。

鱼腥草具有的抗菌、解毒、清热功效同样是挥发油在其中发挥作用，挥发油能抑制微生物的生长，特别是对金葡萄球菌、肺炎球菌具有很好的抑制作用。在清热作用方面，动物在发热的情况下，可进行注射或者灌服，通常能在24 h内使动物的体温降低，同时鱼腥草还能有效解除动物的湿毒、热毒等[2]。

1.2.5 幼苗叶片光合参数的测定 分别于盐胁迫处理24、48 和72 h 后，取小麦幼苗叶片的最新展开叶，持便携式光合仪测定其光合速率、气孔导度、胞间二氧化碳 (CO2) 浓度和蒸腾速率等光合参数，每处理重复9 次。固定小麦幼苗的最新展开叶，暗处理20 min，用便携式荧光仪测定PSII最大光能转换效率 (Fv/Fm)，每处理重复5 次。

1.2.6 幼苗叶绿素含量的测定 参照文献方法[21]进行。盐胁迫处理8 d 后提取小麦幼苗叶绿素，用分光光度计测定提取液在波长663 和645 nm 处的吸光度，计算叶绿素a 和b 的含量。

1.2.7 幼苗叶片抗氧化酶活性和细胞膜损伤程度的测定 盐胁迫处理4 d 后，取小麦幼苗最新展开叶，根据试剂盒说明测定CAT、SOD、POD 活性以及MDA 含量；采用考马斯亮蓝法[20]测定可溶性蛋白含量；采用酸性茚三酮法[20]测定脯氨酸含量；使用电导率仪测定溶液电导率，计算相对电导率[22]。

1.2.8 幼苗叶片内源激素含量的测定 盐胁迫处理4 d 后，取小麦幼苗最新展开叶，用酶联免疫吸附法测定植物内源IAA[23]和内源ABA[24]的含量。

1.2.9 数据分析 采用 Excel 2016 软件对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 5 种ABA 功能类似物对小麦幼苗耐盐性的影响

2.1.1 对盐胁迫下小麦幼苗生长的影响 用5 种ABA 功能类似物处理后，再用含300 mmol/L 的NaCl 营养液培养8 d。结果 (图1) 表明：与对照(CK) 相比，盐胁迫显著抑制了小麦幼苗生长，表现为叶片失绿、黄萎，植株脱水严重，株高显著降低。5 种ABA 功能类似物处理均能明显减弱盐胁迫对小麦幼苗的伤害，与只有盐胁迫的幼苗(SCK)相比，处理后的小麦幼苗叶片卷曲程度变小，叶片干黄程度降低，株高明显高于SCK，其中，TFQB、TFTQB 和NA 的处理效果最好，好于ABA，QB 效果次之，IQB 效果最小。

由图2 可以看出：与CK 相比，盐胁迫处理(SCK) 可使小麦幼苗鲜重和干重都显著降低，但外源施用ABA 功能类似物可以有效提高盐胁迫下小麦幼苗的鲜重和干重。与SCK 相比，ABA 功能类似物处理可使盐胁迫下小麦幼苗地上部鲜重增加8.71%～23.96%，根鲜重增加20.81%～28.15%；地上部干重增加9.15%～16.34%，根干重增加11.36%～26.14%。该结果与图1 的表型一致。

图1 5 种ABA 功能类似物对盐胁迫下小麦幼苗生长的影响Fig. 1 Effects of five ABA functional analogues treatment on the growth of wheat seedlings under salt stress

图2 5 种ABA 功能类似物对盐胁迫下小麦幼苗生物量的影响Fig. 2 Effects of five ABA functional analogues treatment on the biomass of wheat seedlings under salt stress

2.1.2 对盐胁迫下小麦幼苗根系生长的影响 作物根系的生长状况和产量直接相关。如图3A 所示，正常条件下(CK)小麦幼苗根系生长良好，盐胁迫处理 (SCK) 可使小麦幼苗的根长明显变短，次生根数目明显减少。经5 种ABA 功能类似物处理后，与SCK 相比，小麦幼苗的根长增加，次生根数目增多，其中TFTQB 处理的效果最好，幼苗根长增加了43.63% (图3B)，根表面积增加了52.86% (图3C)，根体积增加了80.46% (图3D)。

图3 5 种ABA 功能类似物对盐胁迫下小麦幼苗根系的影响Fig. 3 Effects of five ABA functional analogues treatment on the root system of wheat seedlings under salt stress

2.1.3 对盐胁迫下小麦幼苗叶片相对含水量的影响 叶片相对含水量不仅反映了植物组织内的水分状况，也反映出植物自身保持水分含量的能力。如图4 所示，正常生长 (CK) 的小麦叶片相对含水量高达94.58%，盐胁迫 (SCK) 下小麦幼苗叶片相对含水量则显著降低。与SCK 相比， QB、TFQB、NA 和TFTQB 处理均可明显提高叶片相对含水量，从而显著降低盐胁迫下小麦幼苗的水分亏缺程度，但IQB 对抑制小麦幼苗水分亏缺没有明显作用。

图4 5 种ABA 功能类似物对盐胁迫下小麦幼苗叶片相对含水量的影响Fig. 4 Effects of five ABA functional analogues treatment on leaf relative water content of wheat seedlings under salt stress

2.2 5 种ABA 功能类似物提高作物抗盐作用机理初探

2.2.1 对盐胁迫下小麦幼苗光合系统的影响 从图5 可以看出，在盐胁迫1～3 d 内，小麦幼苗的各种光合参数，包括光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度和蒸腾速率均显著下降，说明幼苗生理代谢能力降低。与SCK 相比，ABA 及其功能类似物的处理都促进了盐胁迫下小麦幼苗的光合作用，减缓了光合速率和胞间CO2浓度降低的幅度，其中TFTQB 和NA 抑制盐胁迫导致的光合速率下降效果最好，好于ABA (图5A)，NA 对盐胁迫导致的胞间CO2浓度降低的恢复效果最好，好于ABA(图5C)。在整个盐胁迫过程中，ABA 及其功能类似物对幼苗叶片气孔导度(图5B)和蒸腾速率(图5D)降低的恢复没有明显效果。

图5 5 种ABA 功能类似物对盐胁迫下小麦光合参数的影响Fig. 5 Effects of five ABA functional analogues treatment on the photosynthetic parameters of wheat under salt stress

逆境条件下，植物的光合作用会受到严重抑制，叶绿素荧光参数可以对植物光合系统的动态变化进行有效监测[25]。Fv/Fm 反映了PSII 最大光能转换效率，据报道，外源ABA 可以显著提高盐胁迫下小麦幼苗叶片的Fv/Fm[26]。如图6A 所示，小麦的Fv/Fm 随着盐胁迫时间的延长而降低，ABA 功能类似物处理后均能有效抑制叶片Fv/Fm的下降幅度，使Fv/Fm 保持在较高的水平。其中NA 处理的效果最佳，明显优于ABA 和其他4 种功能类似物。

图6 5 种ABA 功能类似物对盐胁迫下小麦幼苗叶片叶绿素的影响Fig. 6 Effects of five ABA functional analogues treatment on the chlorophyll of wheat seedling leaves under salt stress

叶绿素是色素-蛋白质复合物的核心成分，参与植物的光呼吸过程，在植物光合作用中发挥着关键作用。逆境胁迫下，叶绿素会严重降解[27]。由图6B～6D 可以看出，盐胁迫处理组小麦幼苗的叶绿素a 和叶绿素b 含量都明显下降，其中叶绿素b 含量下降幅度更大。除化合物TFQB 外，其他4 种ABA 功能类似物均能显著减缓盐胁迫下小麦幼苗叶片叶绿素含量下降的幅度，且效果都好于ABA，其中以QB 的促进作用最大，总叶绿素含量比SCK 提高了33.32%，但TFQB 处理对促进盐胁迫下小麦幼苗叶绿素含量的提高没有作用。

2.2.2 对盐胁迫下小麦幼苗抗氧化酶活性的影响

盐胁迫下植物体内会产生大量的活性氧，进而对植物组织造成不利影响，植物体内多种抗氧化酶参与清除活性氧，以保证植物体内生理过程有序进行。研究表明，当外源ABA 的浓度低于100 μmol/L 时，可诱导玉米幼苗叶中的多种抗氧化酶活性提高[28]。本研究中，盐胁迫使小麦幼苗CAT 活性、POD 活性和SOD 的活性显著提高(图7)。与SCK 相比，5 种ABA 功能类似物处理均可显著提高CAT、POD 和SOD 的活性，其中TFQB 处理可使CAT 活性提高3.3 倍；TFTQB 对POD 活性的提高最有效，增加了86%； NA 对SOD 酶活性的提高最有效。以上结果表明，5 种ABA 功能类似物能明显提高盐胁迫下小麦幼苗抗氧化酶的活性。

图7 5 种ABA 功能类似物对盐胁迫下小麦幼苗叶片抗氧化酶活性的影响Fig. 7 Effects of five ABA functional analogues treatment on antioxidant enzyme activities in leaves of wheat seedling under salt stress

2.2.3 对盐胁迫下小麦幼苗叶片相对电导率和丙二醛含量的影响 相对电导率和MDA 含量是衡量细胞膜损伤程度的关键指标。研究表明，外源ABA 可以显著降低逆境胁迫下植物体内MDA 含量和相对电导率[29]。本研究中，盐胁迫下小麦幼苗的相对电导率提高了5.9 倍，说明盐胁迫使植物细胞膜透性增大，细胞内含物外渗严重 (图8A)。经5 种ABA 功能类似物处理后，盐胁迫导致的幼苗叶片的相对电导率升高幅度降低，其中TFQB对盐胁迫导致的细胞膜受损具有最好的保护作用，IQB 对细胞膜的保护效果最小，电导率仅比SCK 降低了11%。5 种ABA 功能类似物都能明显抑制盐胁迫导致的小麦幼苗叶片内MDA 含量升高 (图8B)，其中TFQB 和NA 的效果最好，但仍弱于ABA。

图8 5 种ABA 功能类似物对盐胁迫下小麦幼苗叶片相对电导率和MDA 含量的影响Fig. 8 Effects of five ABA functional analogues treatment on the relative conductivity and MDA content in the wheat leaves under salt stress

2.2.4 对盐胁迫下小麦幼苗渗透调节物质积累的影响 脯氨酸是细胞膜的稳定剂、保护性渗透分子和自由基清除剂。在逆境胁迫下，植物体会产生大量脯氨酸[30]，外源施用ABA 可以使逆境胁迫下植物体内的脯氨酸含量增加[31]，在逆境胁迫下，可溶性蛋白含量也会增加。

如图9A 所示，盐胁迫 (SCK) 使小麦幼苗叶片中的可溶性蛋白含量增加，5 种ABA 功能类似物均显著提高了叶片中可溶性蛋白含量，但效果略低于ABA。如图9B 所示，盐胁迫 (SCK) 使叶片中脯氨酸含量增加了77 倍，而5 种ABA 功能类似物可进一步增加盐胁迫下小麦幼苗叶片中的脯氨酸含量。

图9 5 种ABA 功能类似物对盐胁迫下小麦幼苗渗透调节物质含量的影响Fig. 9 Effects of five ABA functional analogues treatment on the content of osmotic adjustment substances in wheat seedlings under salt stress

2.2.5 对盐胁迫下小麦幼苗内源生长素和脱落酸含量的影响 当植物遭受逆境胁迫时，植物体内的各种激素含量会发生改变，不同植物激素含量的变化可以通过调节植物的多种生理生化反应使植物更好地适应逆境，植物的抗盐胁迫反应往往是通过多种内源激素的相互作用以复杂的方式进行调控的[32]。从图10 可以看出，盐胁迫 (SCK) 可使小麦幼苗内源生长素 (IAA) 含量增加26.08%，ABA 含量增加6 倍。经ABA 及其功能类似物处理后，与SCK 相比，小麦幼苗IAA 含量显著降低，甚至明显低于对照。5 种类似物处理可显著提高内源ABA 含量，其中以NA 效果最显著。

图10 5 种ABA 功能类似物对盐胁迫下小麦幼苗内源生长素和脱落酸含量的影响Fig. 10 Effects of five ABA functional analogues treatment on the IAA and endogenous ABA content in wheat seedling under salt stress

3 结论

5 种ABA 功能类似物处理均能显著促进盐胁迫下小麦幼苗的生长， 其中TFQB、NA 和TFTQB效果最好，NA 和TFTQB 能够显著促进盐胁迫下小麦幼苗的根系生长。初步作用机制研究表明，5 种ABA 功能类似物能显著改善盐胁迫下小麦幼苗的光合效率、抗氧化酶活性、细胞膜受损状况及渗透调节物质，但不同功能类似物对抑制Fv/Fm 下降趋势、维持胞间CO2浓度和降低MDA含量等生理指标的影响程度存在差异。同时，5 种ABA 功能类似物处理都能显著降低小麦幼苗内源IAA 含量，提高内源ABA 含量。ABA 和NA在提高内源ABA 含量上存在显著差异，表明ABA和NA 在启动ABA 信号途径以及提高抗逆效果方面比其他4 种类似物更有效。本研究结果可为ABA功能类似物在提高小麦幼苗耐盐性的实际生产应用提供参考依据，也可为进一步深入研究这5 种ABA功能类似物在抗逆信号途径中的作用奠定基础。

致谢：感谢中国农业大学农学院谭伟明教授在植物生理相关试验上给予的指导和帮助！

谨以此文庆贺中国农业大学农药学学科成立70 周年。

Dedicated to the 70th Anniversary of Pesticide Science in China Agricultural University.

作者简介：

刘贯园，女，2018 年毕业于山东农业大学植物保护学院制药工程(农药方向) 专业，获学士学位，2020 年毕业于中国农业大学理学院化学专业，获理学硕士学位，现工作于北京生物制品研究所有限责任公司。

肖玉梅，女，2003 年于中国农业大学生物学院获植物生理学博士，现为中国农业大学理学院应化系教授。主要从事新农药创制及其作用机制方面的研究工作。主要参加国家自然科学基金、国家重点研发计划和科技支撑科研项目多项。主编和副主编《有机化学》和《有机化学实验》等教材共计4 本， 2019 年获得全国高校教师微课大赛一等奖(生命科学类)，并多次获得中国农业大学教学成果奖。

覃兆海，男， 1992 年毕业于中国科学院上海药物研究所，获理学博士学位。现任中国农业大学教授、博士生导师。长期从事有机化学教学与科研工作，主要研究方向为新农药创制。先后主持了20 余项国家级科研项目，在线粒体呼吸链复合物抑制剂、脱落酸类合成植物激素、新烟碱类杀虫剂等领域开展了比较系统的研究工作。现任《农药学学报》常务编委和《中国农业大学学报》编委。