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独角仙雄虫水提取物对小鼠的镇痛作用

2022-10-25莫云海周卫青刘立伟潜茁林徐华潮

安徽农业大学学报 2022年4期
关键词:百分率独角提取物

莫云海,周卫青,刘立伟,潜茁林,韩 磊,徐华潮*

(1. 浙江农林大学林业与生物技术学院,临安 311300;2. 浙江省淳安县林业局,淳安 311700;3. 浙江自然博物院,杭州 310000)

疼痛是临床常见不适的自觉症状,在很多急慢性炎症性疾患中都可以见到,患者经常承受很大痛苦,严重干扰正常的工作生活[1]。目前,西药多用于治疗各种急慢性疼痛,其中一种是阿片类镇痛药,如杜冷丁、吗啡等,这类镇痛药虽然镇痛效果显著,但长期使用会产生成瘾、依赖等多种副作用,临床应用受到严格限制,另一种是非阿片类镇痛药(如非甾体类抗炎药)、复方阿司匹林和去痛片,仅用于治疗轻度疼痛,并且对胃、肠道有不同程度的不良反应。中医药在几千年的药用历史中已证实具有明显而确切的镇痛、抗炎作用,且毒副作用小[2-3]。独角仙(Trypoxylus dichotomus)入药最早记载于《本草纲目》具有镇惊、化瘀、解毒和通便的功效且具有较好的镇痛效果。

独角仙又名双叉犀金龟,鞘翅目犀金龟科。分布于中国、朝鲜半岛、日本、老挝和马来西亚,国内分布于辽宁、浙江和河北等省[4]。数量过多的独角仙会对森林造成严重的损害,独角仙主要危害杏树、桃树和梨树等的新枝嫩枝或新生树干,导致新枝、新叶枯萎死亡,果实减产[5-6]。独角仙的成虫和幼虫均可入药,成虫药材名独角蜣,幼虫药材名蛴螬。从独角仙中提取到一种名为独角仙素(dicotastin)的物质被证实有一定的抗癌作用, 并且对实体瘤W-256 癌瘤具有较高的活性, 对P-388 淋巴白血癌具有边缘活性,其他各国医学学者对此极其关注[7]。

目前国内外对于独角仙的研究主要集中在幼虫的抗炎作用、幼虫肠道微生物及幼虫对高脂肪饮食诱导的肥胖调节作用等方面[8-11],关于独角仙成虫的研究主要包括其生活习性、发生规律、危害程度与防治方法以及独角仙的人工饲养等。已有文献记载独角仙雄虫可入药,然而关于独角仙雄虫药用价值的研究还鲜见报道。独角仙在我国分布广泛,资源丰富,目前我国已有比较成熟的人工饲养技术[4],饲养方便,为独角仙在中药领域的研发与利用提供了深厚的资源基础。近年来,独角仙危害越来越严重,啃食各种果实及树干树枝,对农业生产造成巨大的损害,引起不小的经济损失,如果能将其变害为宝,开发其药用价值,将减少其经济损失,增加社会生产。本实验通过对独角仙雄虫水提取物对小鼠镇痛作用的研究,以醋酸致小鼠扭体次数以及小鼠痛阈值为镇痛指标,探究独角仙雄虫水提取物对小鼠疼痛的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

独角仙在浙江省金华市磐安县野外捕获,通过浙江农林大学林生院森林保护的徐华潮教授鉴定,确定为独角仙。

冰醋酸;生理盐水;阿司匹林肠溶片,粉碎后加入生理盐水配制成25 g·L-1的溶液;FA1204B 型电子天平;S20152363 Avanti J-26XP 落地式高速离心机;RV 10 auto pro V-C 旋转蒸发仪;BHS-1 型水浴锅;800 型粉碎机。

ICR 小鼠:雌性60 只,雄性30 只,SPF 级,体重(20 ± 2)g,由杭州医学院(HMC)提供。使用许可证:SYXK(浙) 2018—0010。合格证编号:20210908Abbz0100018621。本实验完全遵守《实验动物管理条例》,按照动物实验伦理规范进行实验。动物伦理编号:ZAFUAC2021022。

1.2 方法

1.2.1 独角仙雄虫水提取物的制备 取独角仙干燥雄性成虫150 g,用研钵捣碎得到粗粉,粗粉在55 ℃的干燥箱中干燥36 h 后,用粉碎机碾成细粉,称取100 g 独角仙雄虫细粉,用1 000 g 蒸馏水、800 g蒸馏水和800 g 蒸馏水先后加热提取3 次,每次加热提取30 min,过滤以后收集滤液,将滤液至于旋转蒸发仪中旋转蒸发,直至形成浸膏,得到独角仙水提取物。实验时加蒸馏水混合,搅拌均匀,配制成0.13、0.26 和0.52 g·mL-1的溶液[12]。

1.2.2 醋酸致小鼠扭体反应实验 将30 只健康灵活的ICR 小鼠随机分成5 组,每组6 只,雌雄各半,5 组分别为:独角仙雄虫水提取物低、中、高剂量组,空白对照组和阳性药阿司匹林组。独角仙水提取物低、中、高剂量组分别灌胃给药1.3、2.6 和5.2 g·kg-1;空白对照组灌胃生理盐水0.01 mL·g-1;阳性药阿司匹林组灌胃阿司匹林0.25 g·kg-1,每日早9:00灌胃给药1 次,持续3 d。最后一天给药60 min 后,各小鼠腹腔注射给药0.6%冰醋酸0.01 m L·g-1,观察并记录腹腔注射后0 ~ 15 min 内每只小鼠进行扭体的情况和次数,并计算镇痛百分率[12-14]。

镇痛百分率=((空白对照组平均扭体次数-用药组平均扭体次数)/空白对照组平均扭体次数)×100%

1.2.3 小鼠甩尾痛阈值检测 实验小鼠分组和给药方法同实验1.2.2。最后一次给药60 min 后,将小鼠鼠尾末端2 cm 浸入(50 ± 0.5) ℃的热水,观察小鼠鼠尾入水到小鼠甩尾出水情况,并记录其入水至出水的时间差,每只小鼠测量3 次,取3 次测量结果的平均值视为该小鼠的甩尾痛阈值[12-14]。

1.2.4 小鼠热板痛阈值检测 实验前对小鼠痛阈值进行筛选,将雌性ICR 小鼠放在55 ℃的智能热板仪上,小鼠放上热板至其出现舔后足反应的时间间隔视为痛阈值,痛阈值小于5 s 的和痛阈值大于30 s的小鼠不进行实验,其余的小鼠为合格痛阈并进行实验。将30 只筛选出的雌性小鼠随机分为5 组,每组6 只,给药方法同实验1.2.2。在最后一天给药30、60 和120 min 之后分别测量一次小鼠的热板痛阈值。如果达到60 s 时小鼠仍无反应,则立即将小鼠取出,避免烫伤小鼠,该小鼠痛阈值视为60 s。实验结束以后,计算镇痛百分率[12-14]。

镇痛百分率=((给药组平均痛阈-给药前平均痛阈)/给药前平均痛阈)×100%

1.2.5 毒性作用检测 观察并记录以上3 个镇痛实验过程中,从第1 次给药到第3 次给药期间的48 h 内,小鼠的死亡率。

2 结果与分析

2.1 独角仙雄虫水提取物对醋酸致小鼠扭体实验影响

腹腔注射冰醋酸后,各组小鼠均表现出腹部后缩、腹部前壁贴近笼底、髋部偏斜和后肢伸展等特殊姿势。阳性药阿司匹林组、独角仙雄虫水提取物低、中、高剂量组与空白对照组比较,小鼠的扭体次数均明显减少(P< 0.01) ,具有统计学意义,独角仙水提取物对醋酸致小鼠疼痛起到一定的止痛作用;与空白对照组比较,独角仙雄虫水提取物低、中、高浓度组镇痛百分率达到51.3%、34.78%和48.56%。在醋酸致小鼠扭体反应实验中,独角仙雄虫水提取物低、中、高剂量组的镇痛效果均低于阿司匹林组,且低浓度组优于中浓度和高浓度组(表1)。

表1 独角仙雄虫水提取物对醋酸致小鼠扭体反应的影响( n = 6,¯x ± s)Table 1 Effects of aqueous extract of male rhinoceros beetle on writhing response induced by acetic acid in mice( n = 6,¯x ± s)

2.2 独角仙雄虫水提取物对小鼠甩尾痛阈值影响

把给药60 min 后的小鼠尾部2 cm 左右浸入50 ℃的热水中,都出现了小鼠尾部抬起的甩尾现象。独角仙雄虫水提取物低、中、高剂量组与空白对照组相比,小鼠鼠尾在热水中时间间隔明显延长,独角仙雄虫水提取物低、中、高浓度组均有不同程度的提高小鼠痛阈值 (P<0.05 或P<0.01) ,独角仙水提取物高浓度组痛阈值最高,镇痛效果最好(表2)。

表2 独角仙雄虫水提取物对小鼠甩尾痛阈值影响(n=6,±s)Table 2 Effects of aqueous extract of male rhinoceros beetle on reaction time of mouse tail flailing pain (n=6,±s)

表2 独角仙雄虫水提取物对小鼠甩尾痛阈值影响(n=6,±s)Table 2 Effects of aqueous extract of male rhinoceros beetle on reaction time of mouse tail flailing pain (n=6,±s)

组别 给药剂量/(g·kg-1) 痛阈值/s CKa — 4.11 ± 0.16 CKb 0.25 5.79 ± 0.33**LD 1.30 4.87 ± 0.14*##MD 2.60 5.16 ± 0.17**#HD 5.20 5.23 ± 0.35**

2.3 独角仙雄虫水提取物对小鼠热板痛反应时间的影响

独角仙雄虫水提取物低、中、高浓度组和阳性药阿司匹林组在给药后30、60 和120 min 显著提高小鼠痛阈值(P< 0.05 或P< 0.01);独角仙雄虫水提取物各浓度组在灌胃30 min 后就开始发挥镇痛作用,且在120 min 后仍保持效果,在3 个时间段均延长小鼠在热板中反应时间;在独角仙雄虫水提取物对小鼠热板痛阈值的影响实验中,中浓度组镇痛效果更好,作用更强。中浓度组在给药60 min 后,镇痛百分率达到39.21%,略低于阳性药阿司匹林组给药60 min 后镇痛百分率,且与阳性药阿司匹林组差异不显著(表3 与表4)。

表3 独角仙雄虫水提取物对热板小鼠痛阈值的影响( n = 6,±s)Table 3 Effects of aqueous extract of male rhinoceros beetle on mice in hot plate apparatus( n = 6,¯x ± s)

表3 独角仙雄虫水提取物对热板小鼠痛阈值的影响( n = 6,±s)Table 3 Effects of aqueous extract of male rhinoceros beetle on mice in hot plate apparatus( n = 6,¯x ± s)

组别 给药剂量/(g·kg-1) 给药前痛阈值/s 给药后痛阈值/s 30 min 60 min 120 min CKa — 16.68±1.98 17.36±2.85 18.90±2.20 17.83±4.04 CKb 0.25 18.20±4.02 26.79±6.56** 26.82±8.52** 26.79±12.87**LD 1.30 17.81±2.21 22.68±4.26**## 22.69±4.40*## 23.35±1.64**#MD 2.60 18.03±3.40 23.97±12.08** 25.10±5.38** 23.50±7.22**#HD 5.20 17.96±4.13 21.85±3.45**## 23.09±7.52**# 23.30±8.64**#

表4 独角仙雄虫水提取物对热板仪致痛小鼠镇痛百分率的影响( n=6,±s)Table 4 Effects of aqueous extract of male rhinoceros beetle on analgesic percentage in mice induced by hot plate apparatus( n = 6,±s)

表4 独角仙雄虫水提取物对热板仪致痛小鼠镇痛百分率的影响( n=6,±s)Table 4 Effects of aqueous extract of male rhinoceros beetle on analgesic percentage in mice induced by hot plate apparatus( n = 6,±s)

组别 给药剂量/(g·kg-1)镇痛百分率/%30 min 60 min 120 min CKa — — — —CKb 0.25 46.65 47.36 46.65 LD 1.3 27.34 27.40 31.11 MD 2.6 32.95 39.21 30.34 HD 5.2 21.65 28.56 29.73

2.4 毒性作用检测

如表5 所示,独角仙雄虫水提取物在给药的48 h 内,对小鼠无毒副作用产生。

表5 独角仙水提物对小鼠的致死性Table 5 Mortality of mice for taking the aqueous extract of male rhinoceros beetle

3 讨论

本研究发现,在醋酸致小鼠扭体反应的实验中,独角仙雄虫水提取物对小鼠的影响与王文春等在苗药青龙方不同提取物的镇痛抗炎作用实验研究结果类似[15],明显减少小鼠的扭体次数;在独角仙雄虫水提取物对小鼠甩尾反应影响的实验中,与牟建平等在苦归妇炎胶囊的镇痛实验研究中的研究结果相似[16],均延长小鼠尾巴在热水中的持续时间,提高小鼠的痛阈值;在热板实验中,独角仙雄虫水提取物对小鼠的影响与肖杨等在重楼皂苷Ⅶ、H 及总皂苷镇痛抗炎作用研究的结果类似[17],均提高给药后小鼠在热板中的反应时间,且效果显著。综上所述,独角仙雄虫水提取物对小鼠具有显著的镇痛作用,且无毒副作用,可为今后开发新型镇痛中药提供依据。

小鼠热板实验与小鼠甩尾实验属于热刺激的致痛模型,醋酸扭体实验是化学刺激的致痛模型。在镇痛实验研究中,PGE2(前列腺素E2)是重要指标,很多研究都证明在外周和中枢组织中PGE2具有诱导疼痛的作用。Ferreira 等[18]通过对大鼠皮下注射PGE2,可导致大鼠痛觉过敏。β-EP(β-内啡肽)是一种内源性阿片肽,具有调节应激反应、免疫机能和中枢镇痛等功能,它可以通过降低神经元P 物质释放,抑制伤害性感受器兴奋,从而达到抑制痛觉传导的作用[19]。BK(缓激肽)在调节疼痛感觉的有关离子通道表达方面起关键作用,是公认的致痛物质[20]。独角仙雄虫水提取物对小鼠的镇痛作用可能与改变小鼠体内PGE2,β-EP 或BK 含量有关,但具体改变了什么物质的含量还有待进一步研究证实。

综上所述,本研究证明独角仙雄虫成虫水提取物对疼痛中的小鼠具有一定的镇痛作用,其作用机制可能与增加或减少小鼠体内PGE2,β-EP 或BK含量密切相关。独角仙有较好的镇惊、镇痛、化瘀等功效,未来将针对独角仙入药的其他功效进行相关研究,并对其发挥作用的具体物质进行探讨,期望能够为独角仙入药提供实验基础。

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