重组人白细胞介素-12注射液蛋白纯度反相高效液相色谱检测方法的建立及验证

王彦娜，孟金，刘忠凯，王媛媛，吴明远，王建刚

康立泰生物医药（青岛）有限公司，山东 青岛 266001

白细胞介素-12（interleukin-12，IL-12）是一种重要的免疫调节细胞因子，相对分子质量约为75 000，由不同基因编码的2个亚基P35和P40通过二硫键共价结合而成［1-2］。IL-12主要由巨噬细胞和树突状细胞产生，作用于T细胞和自然杀伤细胞（natural killer cell，NK），是连接天然免疫和获得性免疫的功能性桥梁［3-6］，具有多种生物学功能，在免疫调节、抗感染和抗肿瘤方面发挥重要作用。重组人IL-12（recombinant human interleukin 12，rhIL-12）是入选“十三五”国家“重大新药创制”科技重大专项的一类生物新药，已进入肿瘤患者放化疗后全血象恢复和肿瘤免疫治疗的临床阶段［7-10］。rhIL-12在生产过程中易受各种理化条件的影响，其产品的质量研究和控制尤为关键。

蛋白质纯度是重组蛋白质药物检测的重要指标之一，一般采用聚丙烯凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE）、高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）和毛细管电泳法等进行检测［11-14］。反相高效液相色谱法（reverse phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）较SDS-PAGE法检测灵敏度更高、重复性更好［15］，其基本原理是用高压输液泵将流动相泵入装有填充剂的反相色谱柱中，色谱固相载体具有疏水性，可根据流动相中分离物质疏水性发生相互作用，从而使不同分子在反相柱中彼此分离。一些细胞因子类的重组生物制药注射液成品中蛋白含量较低，采用常规进样体积，通常处于检测限和定量限下限甚至检测不到，无法确定注射液中蛋白纯度。而注射液在生产、运输和储存过程中生物稳定性较差，必须进行严格的质量研究和质量控制。本研究旨在建立用于rhIL-12注射液蛋白纯度分析的RP-HPLC法，并进行方法验证，以期用于产品的质量控制，为提高产品质量标准、保证药物的生物安全性和有效性奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试品rhIL-12注射液（15 μg／mL）由康立泰生物医药（青岛）有限公司提供，批号为201709005、201807002、201807004、201808006。

1.2 主要试剂及仪器 三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）购自美国Tedia公司；乙腈（acetonitrile，ACN）购自美国Fisher公司；YMC C4液相色谱柱（250 mm×4.6 mm）购自日本YMC公司；Agilent 1260液相色谱仪和Agilent 1260 DAD检测器均购自美国Agilent公司。

1.3 色谱条件 采用YMC C4液相色谱柱（250 mm×4.6 mm）。流动相A：0.05%三氟乙酸-水溶液；流动相B：0.05%三氟乙酸-乙腈溶液；流速为：1.0 mL／min；柱温为：30℃；检测波长为：280 nm；进样体积为：1 000 μL，连续进样10针，100 μL／针。线性洗脱0～5 min：20% B；第10针样品进样后开始进行梯度洗脱：5～15 min：0.05%A比例由80%逐步变为30%，0.05% B比例由20%逐步变为70%；25 min：70% B；26～35 min：100% B；35.5～40 min：20% B。

1.4 方法的验证

1.4.1 专属性 取rhIL-12注射液（批号：201709005）及空白溶剂（流动相A、流动相B、制剂Buffer），采用1.3项色谱条件进行检测，验证该方法的专属性［10］。

1.4.2 适用性 将rhIL-12注射液（批号：201709005）于60℃加热60 min后，采用1.3项色谱条件进行检测，同时以未加热的同批rhIL-12注射液为对照，分析rhIL-12注射液与杂质的分离度，分离度应＞1.5，理论塔板数应≥1 500。

1.4.3 精密性

1.4.3.1 重复性 由实验员1将rhIL-12注射液（批号：201709005）连续进样6次，按1.3项色谱条件进行检测，计算6次检测的主峰保留时间、主峰面积及主峰百分比的RSD，RSD均应≤2.0%。

1.4.3.2 中间精密性 取rhIL-12注射液（批号：201709005），由实验员2于不同时间按1.3项色谱条件进行测定，重复6次试验，计算实验员1和2检测主峰保留时间、主峰面积及主峰纯度的RSD，RSD均应≤2.0%。

1.4.4 检测限及定量限 将rhIL-12注射液（批号：201709005）进行28倍稀释，即0.058 6 μg／mL，按1.3项色谱条件进行测定，同时测定3次空白样品。以信噪比（S／N）=10为定量限，S／N=3为检测限。

1.4.5 耐用性 将流速分别设定为0.9、1.0和1.1 mL／min，对rhIL-12注射液（批号：201709005）进行检测，每个流速检测2次；另将柱温分别设定为28、30、32℃，对rhIL-12注射液（批号：201709005）进行检测，每个温度检测2次。计算主峰保留时间、主峰面积及主峰百分比的RSD，RSD均应≤5.0%。

1.5 方法的应用 取3批rhIL-12注射液（批号为2018-07002、201807004、201808006），按1.3项色谱条件进行检测，测定主峰保留时间，主峰面积及主峰百分比。

2 结果

2.1 方法的验证

2.1.1 专属性rhIL-12注射液的保留时间为16.957 min，积分范围内可见单一目的峰；空白溶剂（流动相A、流动相B、制剂Buffer）在积分范围内均无吸收峰。见图1。表明该方法具有良好的专属性。

图1 专属性试验色谱图Fig.1 Chromatogram of specificity test

2.1.2 适用性rhIL-12注射液降解峰杂质与目的峰分离情况良好，分离度为2.58，理论塔板数为17 666，见图2。表明该方法具有良好的适用性。

图2 适用性试验色谱图Fig.2 Chromatogram of suitability test

2.1.3 精密性

2.1.3.1 重复性 实验员1对rhIL-12注射液进行连续6次进样检测，图谱基本一致，见图3；6次进样检测的主峰保留时间、主峰面积及主峰百分比RSD均<2.0%，见表1。表明该方法具有良好的重复性。

表1 实验员1重复性试验结果Tab.1 Results of reproducibility test by person 1

图3 实验员1重复性试验色谱图Fig.3 Chromatogram of reproducibility test by person 1

2.1.3.2 中间精密性 实验员2对同批次rhIL-12注射液进行6次试验，所得图谱基本一致，见图4。实验人员1和2检测的主峰保留时间、主峰面积、主峰百分比RSD分别为0.33%、0.71%、0.03，均<2.0%，见表2。表明该方法具有良好的中间精密性。

表2 实验员2重复性试验结果Tab.2 Results of reproducibility test by person 2

图4 实验员2重复性试验色谱图Fig.4 Chromatogram of reproducibility test by person 2

2.1.4 检测限及定量限rhIL-12注射液浓度为0.06 μg／mL，进样体积为1 000 μL时（连续10针），满足S／N=3的要求，确定该方法的检测限为0.06 μg，见图5。样品浓度为0.58 μg／mL，进样体积为1 000 μL时，满足S／N=10的要求，确定该方法的定量限为0.58 μg，见图6。

图5 检测限试验色谱图Fig.5 Chromatogram in LOD test

图6 定量限试验色谱图Fig.6 Chromatogram in LOQ test

2.1.5 耐用性0.9、1.0和1.1 mL／min 3个流速检测rhIL-12注射液，图谱基本一致，见图7，主峰百分比RSD为0.05%，见表3；28、30、32℃3个柱温条件下检测图谱基本一致，见图8，主峰百分比RSD为0.09%，见表4。表明该方法具有良好的耐用性。

表3 不同流速耐用性验证结果Tab.3 Verification results of durability test at various flow rates

表4 不同柱温耐用性验证结果Tab.4 Verification results of durability test at various column temperatures

图7 不同流速耐用性试验色谱图Fig.7 Chromatogram of durability test at various flow rates

图8 不同柱温耐用性试验色谱图Fig.8 Chromatogram of durability test at various column temperatures

2.2 方法的应用 批号为201807002、201807004、201808006的rhIL-12注射液纯度分别为99.88%、99.00%和99.53%，见图9和表5。

表5 不同批次rhIL-12注射液纯度结果Tab.5 Purities of rhIL-12 injection of various batches

图9 不同批次rhIL-12注射液色谱图Fig.9 Chromatogram of rhIL-12 injection of various batches

3 讨论

rhIL-12注射液是一种具有广泛生物学活性的细胞生长因子，在相应药物研制过程中，蛋白纯度的检测方法是药物筛选及质量控制的重要评价参数［14］，检测方法必须通过专属性、精密度、准确度等方法验证，满足方法验证的要求才能保证药物检测结果的可靠性和安全性［12］。本实验对用于rhIL-12注射液蛋白纯度检测的RP-HPLC方法进行了验证，结果显示，rhIL-12注射液的保留时间为16.957 min，积分范围内可见单一目的峰，空白溶剂（流动相A、流动相B、制剂Buffer）未见吸收峰；降解峰杂质与目的峰分离情况良好，分离度为2.58，理论塔板数为17 666；连续进行6次进样检测的主峰保留时间、主峰面积及主峰百分比RSD均<2.0%；不同实验人员对同批次rhIL-12注射液进行6次试验的主峰保留时间、主峰面积、主峰百分比RSD均<2.0%；该方法的检测限为0.06 μg，定量限为0.58 μg，0.9、1.0和1.1 mL／min 3个流速检测rhIL-12注射液的主峰百分比RSD为0.05%，28、30、32℃3个柱温条件下检测主峰百分比RSD为0.09%。表明该检测方法具有较好的专属性和精密性，检测限较低，灵敏度高，整个检测方法的系统耐用性也较高。因此该方法可提供准确可靠的检测数据，具有较大的实用价值。

rhIL-12注射液每1次人用剂量为15 μg／mL，蛋白含量较低。在RP-HPLC法中，蛋白质在有机成分浓度较低的洗脱液中，分子与固定相疏水作用强，几乎完全被固定相吸附。根据该原理选择连续进样，将目的组分吸附在色谱柱上，最后一次完全洗脱后检测蛋白纯度。该进样方式适用于蛋白含量较低的产品，通过不断富集便于准确分辨主峰与杂质峰，计算蛋白纯度。

综上所述，本文建立的方法适用于较低蛋白浓度的rhIL-12注射液纯度检测，对于其他低蛋白浓度样品的检测具有借鉴意义。