let-7a及其靶基因在肝细胞癌中作用机制的研究进展

梁雨 综述，沈涛 审校

昆明理工大学附属医院云南省第一人民医院，云南 昆明 650032

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是全球范围内最具侵袭性的恶性肿瘤之一，被认为是癌症相关死亡的第三大常见病因，具有较高的复发率和死亡率［1］。肝癌的发生、发展是多因素、多基因和多步骤综合决定的［2］，如包括HCC的大多数恶性肿瘤中微小RNA（microRNA，miRNA）异常表达，可影响肿瘤的发生、发展、转移和复发。在过去的几十年里，随着诊断和治疗科学技术的发展，尽管HCC的总体生存率得到了提高，但由于HCC对化疗和放疗不敏感，尤其对于肝癌晚期患者，化疗并不能显示出生存优势，其复发和转移仍是亟待解决的难题［3］。因此，开发有效的治疗策略对提高肝癌患者的生存率具有极其重要的意义。

miRNA是长度18～25 nt的非编码调控RNA，在基因表达转录后的调控中发挥重要作用。miRNA通过互补碱基配对与特定的mRNA相互作用，从而影响靶基因的表达或稳定性。研究显示，miRNA可通过靶向不同靶基因，参与不同信号通路，从而在疾病的发生发展、生物发育、器官形成、病毒防御、表观调控及代谢等生命活动起到调控作用［4］。同时，作为非侵入性检测手段获得的标志物，血清或血浆中的miRNA在疾病诊疗中的作用也逐渐受到重视。有研究发现，在乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）相关性肝病中，miRNA表达随疾病进程不同呈显著差异，药物的使用也可使miRNA发生特异的应答性改变［5-6］。随着对miRNA研究的深入，发现一些肝癌发展过程中关键miRNA的抑癌特性，研究显示，人工miRNA和内源性miRNA的结构相似，不会引起内源性反应，因此，研发miRNA相关癌症治疗方法可能是一种安全的治疗途径［7］。目前，miRNA调控肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭转移的功能成为了人们关注的热点。近年研究较多的let-7基因家族最初发现于线虫体内，是一种重要的发育基因，随后确认为最早的miRNA之一。let-7a作为该家族成员之一，参与了细胞的增殖、凋亡等生物学过程，且在多种癌症中发挥肿瘤抑制因子的作用。本文就let-7a及其靶基因在HCC中作用机制的研究进展作一综述。

1 let-7a与癌症的关系

let-7miRNA家族最初在线虫中被发现，是发育过程的主要调节因子，分布在9条不同染色体上。let-7存在多种亚型，由13个成员组成，分别为let-7a-1、let-7a-2、let-7a-3、let-7b、let-7c、let-7d、let-7e、let-7f-1、let-7f-2、let-7g、let-7i、miR-202和miR-98。该家族所有成员的5'端均具有“种子序列”的高度保守核苷酸序列，即“TGAGGTA”。let-7家族基因在发育阶段表达，可促进细胞分化，并随着细胞分化程度的加深，let-7的表达显著增加［8］。已发现包括食管鳞状细胞癌、肺癌、鼻咽癌和卵巢癌等大部分人类恶性肿瘤中，let-7常表现为丢失、减少或失控等异常表达［9］。

let-7a作为let-7miRNA家族的成员之一，在细胞增殖、凋亡、生长和转移等许多细胞生物学过程中发挥重要的作用［10］。多项研究发现，let-7a在肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种肿瘤细胞中表达水平显著下调，且let-7a的表达水平与肺癌和乳腺癌患者的生存时间呈正相关［11-12］。相关机制研究发现，let-7a可通过与靶基因3'端非编码区相结合而调控靶基因的表达，从而在肿瘤的发展过程中扮演重要角色［13］。另有研究发现，高表达的let-7a可导致k-Rasm RNA及蛋白水平显著降低，从而影响肺癌细胞的侵袭和增殖能力［12］。在乳腺癌细胞中，let-7a不仅抑制细胞的体外增殖，还具有诱导凋亡的作用，这可能与肿瘤细胞中c-myc基因及蛋白水平下调有关［13］。由此推测，围绕let-7a及其靶基因展开肿瘤诊治具有十分重要的意义。

2 let-7a对HCC的影响及作用机制

2.1let-7a在HCC诊断中的价值 研究发现，肝癌细胞中microRNAlet-7a-3（MIRLET7A3）基因高甲基化导致let-7a基因转录受到抑制，表达降低［14］。已有报道显示，与健康对照比较，HCC患者血清中let-7a表达水平显著下调［15］，且HCC患者肝癌组织中let-7a的表达也比癌旁组织显著降低［16］，其表达水平的降低与肿瘤的癌栓形成显著相关［15］。同样，在HBV感染的HCC患者肝癌组织中，let-7a的表达也比正常组织显著降低［17-18］。进一步分析发现，尽管肝癌组织中let-7a水平降低，但HBV DNA复制高度活跃（＞106copies／mL）的肝癌组织中，let-7a水平明显高于复制不活跃（＜103copies／mL）的肝癌组织，两者呈正相关［17］。有研究显示，HBV mRNA可通过let-7a反应元件特异性吸附和隔离let-7a，从而解除let-7a对其靶基因（如c-myc、KRAS等）及靶基因信号通路的调控［18］，进而促进HCC的进展。这提示let-7a表达水平在早期HCC的诊断、进展及HBV复制和正常肝转录监测中具有一定价值。

2.2let-7a及其靶基因对HCC的影响及作用机制研究发现，let-7a与肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡等相关，可通过靶向多个靶基因发挥肿瘤抑制作用［9］。已有研究显示，类胰岛素生长因子-2（insulinlike growth factor-2，IGF-2）、Wnt1、N-钙黏蛋白（N-cadherin，N-cad）、Snail、信号传导及转录激活蛋白3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、ras基因等均为let-7a作用的靶标基因［19-36］。

2.2.1let-7a与IGF-2 IGF-2作为类胰岛素生长因子（insulin-like growth factor，IGF）信号通路的关键调控分子之一［19］，不仅在细胞的增殖分化、生长发育等过程中起重要作用，也参与肿瘤发生等多种病理过程［20］。研究发现，在结直肠癌及肝癌发生期间，IGF-2 mRNA表达上调，IGF-2的过度表达可诱导如RAS-Raf-MAPK和PI3K／AKT等信号通路激活，直接影响肿瘤细胞的增殖、抗凋亡及转移［21］。利用let-7a模拟物转染Huh7细胞，let-7a的过表达可显著抑制IGF-2和IGF2BP-2／3转录，通过荧光素酶报告实验证实，let-7a可与IGF-2和IGF2BP-2／3转录本直接结合，即let-7a可通过直接靶向IGF-2或其mRNA结合蛋白IGF2BP-2／3这两种机制来调控肝癌中的IGF-2的表达［14］。IGF-2的表达可抑制阻碍IGF信号通路，从而达到抑癌的目的。

2.2.2let-7a与Wnt1 Wnt1是Wnt基因家族中的成员之一，参与细胞分化、细胞迁移和增殖等生物学过程，其相关途径包括ERK信号传导和Wnt信号传导［22］。Wnt信号传导途径在动物胚胎的早期发育、器官形成、组织再生和其他生理过程中具有至关重要的作用。Wnt1作为Wnt信号通路上游关键因子，其异常表达可诱导如肝癌、胃癌、卵巢癌等多种癌症的发生［23］。通过RNA干扰试验发现，在肝癌干细胞中，let-7a的过表达和Wnt1的敲除均显著抑制了肝癌干细胞的自我更新能力，且在临床肝细胞癌和正常肝组织中，let-7a的表达与Wnt1的表达呈负相关［24］。let-7a通过下调Wnt信号通路活性抑制了Wnt1／β-catenin信号通路，阻止肝癌干细胞的自我更新［25］。另外，Wnt／β-catenin可激活β-catenin／TCF的直接转录靶标Slug，并通过抑制其磷酸化和降解来稳定Snail的表达。Snail可直接靶向上皮向间质转化（epithelial to mesenchymal transition，EMT）过程中的标志物E-cad并抑制其表达，从而触发EMT并促进肿瘤发生和侵袭［26］。另外，Snail、Twist等作为EMT转录因子，可调控肿瘤干细胞的基因表达，从而促进早期癌细胞的侵袭和转移，即EMT可能是干细胞干性维持的重要因素。已发现let-7a可负调节EMT的早期标志物N-cad和Snail的表达，从而抑制肿瘤的转移及发展［25］。因此，利用let-7a可抑制Wnt信号通路活性的特性进行肝癌治疗，有望抑制肝癌干细胞自我更新和干性维持。

2.2.3let-7a与STAT3 STAT3是STAT蛋白质家族成员之一。该蛋白家族激活后能与特定的DNA片段结合，促进其转录。其中STAT3蛋白通过响应各种细胞因子和生长因子（包括IFN、EGF、IL-5、IL-6、HGF、LIF和BMP2）的磷酸化而被激活，并在许多细胞生理过程（如细胞生长和凋亡）中起关键作用［27］。有研究报道，STAT3的表达与实体瘤中抗EGFR治疗药物的疗效相关，let-7a可增强上皮表型肝癌细胞（Huh7、Hep3B和HepG2）对西妥昔单抗的敏感性，但对间质表型肝癌细胞（SNU449和SNU387）无影响［28］；进一步研究其作用机制发现，在这些肝癌细胞系中，let-7a模拟物存在的情况下，STAT3的表达被抑制，进而增强了上皮表型肝癌细胞对西妥昔单抗的敏感性［29］。let-7a通过靶向STAT3抑制癌基因的转录，降低上皮表型肝癌细胞对西妥昔单抗的耐药性，从而影响肝癌的发生发展［30］。提示西妥昔单抗可能与其他补充药物，如microRNAs联合使用，成为治疗肝癌的有前途的二线药物。

2.2.4let-7a与ras基因ras基因最初是在急性转化性逆转录病毒试验中，从Harvey、Kirsten两株大鼠肉瘤病毒中克隆出来的转化基因。CHEN等［31］从人膀胱癌细胞中克隆出活化的癌基因C-Ha-ras后，ras基因在人类肿瘤发生、发展过程中所起的作用开始受到极大关注。ras基因家族与人类肿瘤相关的特征性基因有3种，即H-ras、K-ras和N-ras，分别定位于11、12、1号染色体。ras基因参予细胞生长和分化的调控，并在膀胱癌、胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤中检测出基因表达异常，其中K-ras基因对于人类癌症影响最大［32］。有研究发现，肿瘤细胞中let-7a的过表达可导致ras基因表达水平降低，从而阻止癌症的发展［33-36］。用胆固醇共轭的let-7a（Chol-let-7a）转染肝癌细胞HepG2、SMMC7721后，可检测到let-7amRNA表达上调，而3种ras基因的mRNA和蛋白表达水平均显著降低；同时，经Chol-let-7a处理48 h后，HepG2和SMMC7721细胞的自噬活性增强，胞浆中有丰富的溶酶体和吞噬酶体，核形态有轻微变化，60 h后可见明显的凋亡和坏死细胞［34］。在肝脏原位移植HepG2细胞的肝癌小鼠模型中，用Chol-let-7a处理后，在肝脏肿瘤组织中可检测到高表达let-7a，同时，3种ras基因的mRNA和蛋白表达水平均显著降低，超声检测显示，肿瘤体积明显减小、肿瘤迁移受到抑制、肿瘤组织细胞坏死增加，即Chollet-7a处理后肝脏肿瘤生长受到抑制［33］。提示let-7a可下调ras基因的表达并诱导细胞凋亡，从而使肿瘤发展受到抑制，表明用包括胆固醇等修饰该分子也是一种用于系统性肝癌治疗的潜在手段［16］。

2.3let-7a调控自噬对HCC的影响 自噬是通过清除并降解自身细胞质蛋白或细胞器，实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新，借此维持细胞环境稳态的一种生理过程［37］。近年研究显示，自噬的调节异常是人类恶性肿瘤病理过程中的一个重要特征［38］，但在肿瘤的不同发展阶段，自噬扮演着不同的角色。在肿瘤初始阶段，由Beclin-1、ATG-5等自噬相关基因异常表达可导致自噬活动增强抑制肿瘤发生［39］。研究发现，HCCLM3细胞在缺氧环境下，let-7a表达水平明显下降，细胞自噬活性也明显降低，同时细胞增殖显著增高；利用let-7a模拟物处理后，let-7a的过表达提高了HCCLM3细胞在缺氧状态下的自噬率，使细胞停滞在G1期，进而抑制了细胞的增殖［40］。随着肝癌的发展，肿瘤细胞微环境的变化及药物化疗所导致多种应激状况下，自噬可提高肿瘤细胞的存活并促进转移［41］。由此提示，let-7a调控自噬对于肝癌初期阶段治疗具有巨大的潜在价值。

3 小结

miRNA在肿瘤基础研究、临床诊断、治疗、预后和肿瘤药物发现方面均具有巨大潜力。let-7a作为let-7家族成员之一，在细胞增殖、分化和凋亡过程中发挥重要的生物功能，影响肿瘤的发生发展。在癌症背景下，miR-let-7a大多被认为是一种肿瘤抑制因子，在肝癌中表达降低，let-7a表达水平的变化引起一系列靶基因的异常表达，促进肿瘤的发生、发展和迁移。而let-7a在肿瘤中的研究仍处于初步阶段，更多的靶基因及作用机制尚未明确。因此，let-7a在肝癌中新的作用靶点及在肿瘤发展过程中产生的分子机制尚需进一步深入研究，有利于进一步揭示其在肿瘤诊断和治疗中的潜在价值。