人纤维蛋白原干热病毒灭活效果及灭活前后的质量变化

谢来峰，张学成，罗坚，张伦，王海林，马小伟

1.华兰生物工程股份有限公司研发中心，河南 新乡4 53003；2.中国科学院过程工程研究所，北京 100190

人纤维蛋白原适用于先天性纤维蛋白原减少或缺乏症、严重肝脏损伤、肝硬化、弥散性血管内凝血、产后大出血及大手术、外伤、内出血等引起纤维蛋白原缺乏造成的凝血障碍，是临床上用于大出血、止血的必备急救药品［1-3］。

100 ℃干热30 min是病毒灭活方法之一（以下简称干热灭活），该方法具有操作简便、易于规模生产、病毒灭活效果好等优点，是确保人纤维蛋白原制品安全性的最后一道工序。该方法的原理为人纤维蛋白原冻干后经加热处理，破坏病毒蛋白分子结构，从而达到灭活病毒的目的［1］。但受水分含量、制品组成等因素的影响，不同工艺制备的人纤维蛋白原干热灭活的效果不同［4-5］。文献报道表明，人纤维蛋白原干热灭活会导致蛋白变性，出现絮状沉淀，降低药品质量［1］。因此，本研究对3批人纤维蛋白原干热灭活的效果进行评价，同时对比其干热前后的质量变化。

1 材料与方法

1.1 供试品 人纤维蛋白原（含氯化钠、枸橼酸钠、精氨酸、蔗糖、甘氨酸）由华兰生物工程股份有限公司制备，批号分别为S20171005、S20171006、S20171007。

1.2 病毒及细胞Sindbis病毒、脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）及Vero细胞均购自中国食品药品检定研究院。

1.3 主要试剂及仪器 蛋白质荧光染料SYPRO®Orange购自美国Sigma-Aldrich公司；LC-20A型高效液相色谱仪购自岛津仪器（苏州）有限公司；TSK G4000SWxl型色谱柱（7.5 mm×300 mm）购自日本东曹株式会社（TOSOH）；J-810型圆二色谱仪购自日本分光株式会社（JASCO）；F-4500型荧光光谱仪购自株式会社日立制作所（Hitachi）；7500 Fast RT-PCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.4 样品的干热灭活 取3批人纤维蛋白原，将样品与病毒按9∶1的体积比分别加入Sindbis病毒和EMCV，冻干后，于（99.5±0.5）℃下进行干热灭活，采用96孔微量细胞病变法［6］检测冻干前、干热前（冻干后）、干热5、15、30 min样品的病毒滴度。

1.5 可见异物检查 分别取3批干热前／后（30 min）人纤维蛋白原样品，参照《中国药典》三部（2015版）［7］通则0904可见异物检查法进行检查。

1.6 稳定性试验 分别取3批干热前／后（30 min）人纤维蛋白原样品，参照《中国药典》三部（2015版）［7］各论“人纤维蛋白原”中稳定性试验方法判定样品稳定性。

1.7 纯度检测 分别取3批干热前／后（30 min）人纤维蛋白原样品，参照《中国药典》三部（2015版）［7］各论“人纤维蛋白原”中纯度检测方法进行检测。

1.8 凝固活力检测 分别取3批干热前／后（30 min）人纤维蛋白原样品，参照《中国药典》三部（2015版）［7］各论“人纤维蛋白原”中凝固活力检测方法进行检测。

1.9 SDS-PAGE分析 分别取3批干热前／后（30 min）人纤维蛋白原样品，参照《中国药典》三部（2015版）［7］通则0541电泳法进行12% SDS-PAGE分析。

1.10 高效液相分子排阻色谱（high performance liquid chromatography-size exclusion chromatography，HPLCSEC）将3批干热前／后（30 min）人纤维蛋白原样品稀释至5 mg／mL，参照《中国药典》三部（2015版）［7］通则0514的HPLC-SEC法进行测定纯度。

1.11 圆二色光谱 将3批干热前／后（30 min）人纤维蛋白原样品稀释至0.5 mg／mL，采用J-810型圆二色谱仪进行检测，设置带宽为1 μm，响应时间为1 s，扫描速率为100 nm／min，测量范围为190～260 nm。

1.12 荧光光谱 将3批干热前／后（30 min）人纤维蛋白原样品稀释至1 mg／mL，设置激发波长为295.0 nm，发射波长范围为300.0～500.0 nm，扫描速率为1 200 nm／min。

1.13 差示扫描荧光（differential scanning fluorimetry，DSF） 将3批干热前／后（30 min）人纤维蛋白原样品稀释至5 mg／mL，与荧光染料（50倍稀释）按1∶19混合均匀，加入96孔板，220×g离心2 min去除气泡，进行检测。RT-PCR仪设置实验类型为熔解曲线，模式为continuous，温度扫描范围为25～95℃，升温速率为1%（约1℃／min），25℃平衡3 min，报告基团为ROX，淬灭基团为None，反应体积20 μL。

1.14 统计学分析 应用EXCEL软件进行统计学分析，试验数据采用均值±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 干热灭活效果 冻干前至干热30 min，3批人纤维蛋白原样品Sindbis病毒滴度降低量分别为6.13、5.88、6.00 LgTCID50／0.1 mL，EMCV滴度降低量分别为≥4.94、≥4.68、≥5.00 LgTCID50／0.1 mL，均＞4.00 LgTCID50／0.1 mL，见表1。表明干热法可有效灭活人纤维蛋白原样品中的脂包膜和非脂包膜病毒。

表1 3批人纤维蛋白原干热灭活后的病毒滴度（LgTCID50／0.1 mL）Tab.1 Virus titers of three batches of human fibrinogen after inactivation by dry heat（LgTCID50／0.1 mL）

2.2 可见异物及稳定性试验3批干热前／后（30 min）人纤维蛋白原样品可见异物和稳定性试验均合格。

2.3 纯度3批人纤维蛋白原样品干热前纯度分别为87.3%、86.9%、88.9%，均值为（87.7±0.9）%；干热后（30 min）纯度分别为85.7%、89.2%、88.3%，均值为（87.7±1.5）%。干热前后均值差异无统计学意义（F=0.001，P=0.98）。

2.4 凝固活力3批人纤维蛋白原样品干热前凝固活力分别为19、17、18 s，均值为（18±0.8）s；干热后（30 min）凝固活力分别为17、18、18 s，均值为（18±0.5）s。干热前后均值差异无统计学意义（F=0.250，P=0.64）。

2.5 SDS-PAGE分析 干热前／后（30 min）人纤维蛋白原样品经SDS-PAGE分析，均可见相对分子质量约65 000、56 000和47 000的目的蛋白条带，未见裂解条带，见图1。

图1 人纤维蛋白原样品的SDS-PAGE图谱Fig.1 SDS-PAGE profile of human fibrinogen

2.6 HPLC-SEC 3批人纤维蛋白原样品干热前HPLC纯度分别为83.95%、86.82%、87.70%，均值为（86.16±1.60）%；干热后（30 min）纯度分别为86.99%、85.44%、86.66%，均值为（86.36±0.67）%。干热前后均值差异无统计学意义（F=0.028，P=0.87），且未见裂解峰和聚集峰，见图2。

图2 人纤维蛋白原样品HPLC-SEC叠加图Fig.2 Overlay HPLC-SEC profile of human fibrinogen

2.7 圆二色光谱 干热前／后（30 min）3批人纤维蛋白原样品的α螺旋结构比例均值分别为（42±2.4）%和（45±1.2）%，差异无统计学意义（F=3.780，P=0.12）；β折叠结构比例均值分别为（15±1.7）%和（14±0.5）%，差异无统计学意义（F=1.790，P=0.25）；β转角结构比例均值分别为（16±0.9）%和（16±0.8）%，差异无统计学意义（F=0.140，P=0.72）；无规卷曲结构比例均值分别为（27±0.5）%和（26±0）%，差异无统计学意义（F=4.000，P=0.11）。见图3和表2。

表2 人纤维蛋白原样品二级结构比例（%）Tab.2 Ratio of secondary structure of human fibrinogen（%）

图3 人纤维蛋白原样品圆二色光谱检测杨氏曲线Fig.3 Determination of Young curve of human fibrinogen by circular dichroism

2.8 荧光光谱3批人纤维蛋白原样品干热前最大荧光发射光谱分别为342.2、341.6、342.0 nm，均值为（341.9±0.2）nm；干热后（30 min）最大荧光发射光谱分别为341.8、342.2、342.4 nm，均值为（342.1±0.2）nm。干热前后均值差异无统计学意义（F=0.640，P=0.47），见图4。

图4 人纤维蛋白原样品荧光光谱叠加图Fig.4 Superposition of fluorescence spectra of human fibrinogen

2.9 DSF干热前／后（30 min）3批人纤维蛋白原样品热转变中点温度1（mid point temperature of thermal transition 1，Tmid 1）均值分别为（47.84±0.09）和（47.36±0.36）℃，差异无统计学意义（F=0.680，P=0.46）；Tmid 2均值分别为（52.34±0.15）和（52.19±0.33）℃，差异无统计学意义（F=0.560，P=0.50）。见表3。

表3 人纤维蛋白原样品Tmid值（℃）Tab.3 Tmid value of human fibrinogen（℃）

3 讨论

Sindbis病毒是丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）的指示病毒，属于脂包膜病毒；EMCV是甲型肝炎病毒（hepatitis A virus，HAV）的指示病毒，属于非脂包膜病毒。3批人纤维蛋白原样品干热灭活后，Sindbis病毒滴度降低量分别为6.13、5.88、6.00 LgTCID50／0.1 mL，EMCV滴度降低量分别为≥4.94、≥4.68、≥5.00 LgTCID50／0.1 mL，表明经干热灭活后，脂包膜和非脂包膜病毒滴度下降均≥4.00 LgTCID50／0.1 mL，依据《血液制品去除／灭活病毒技术方法及验证指导原则》判定，干热灭活是有效的病毒灭活方法。样品冻干后，Sindbis病毒和EMCV滴度均降低，表明冻干过程是干热灭活的重要组成步骤，因此，在生产和实验过程中，除精确控制干热温度、时间等参数外，还应注重冻干参数的控制，才能达到预期的病毒灭活效果，保证制品安全性。

文献报道表明，人纤维蛋白原干热灭活可能会影响制品质量［1］。通过对比3批人纤维蛋白原样品干热前／后可见异物、稳定性、纯度、凝固活力、SDS-PAGE、HPLC-SEC纯度、圆二色光谱、荧光光谱、DSF等检测结果，表明干热前后样品的可见异物、稳定性均符合《中国药典》三部（2015版）［7］规定；纯度、凝固活力差异无统计学意义（P＞0.05）；SDSPAGE图谱未见裂解条带，且与干热前样品图谱基本一致；HPLC-SEC纯度差异无统计学意义（P＞0.05），且干热后样品紫外吸收峰未见裂解峰和聚集峰。蛋白质二级结构主要包括α螺旋、β折叠、β转角和无规卷曲［8］，常规方法采用圆二色光谱法测定［9-10］。本实验结果表明，干热前／后样品的4种二级结构比例差异均无统计学意义（P＞0.05），表明干热灭活对蛋白质二级结构无影响。蛋白质三级结构是在二级结构的基础上，通过氨基酸链侧基团之间的疏水相互作用、氢键、范德华力和静电作用等次级键作用下进一步卷曲、折叠形成。色氨酸是蛋白质最主要的内源荧光探针。当蛋白质去折叠，色氨酸暴露于极性溶剂中，荧光光谱发生红移，通过扫描荧光发射波长的变动可分析蛋白质三级结构的变化［11-13］。本实验结果表明，干热前／后样品的最大荧光发射波长差异无统计学意义（P＞0.05），表明干热灭活对蛋白质三级结构无影响。DSF测定的Tmid值可作为衡量溶液中蛋白质热稳定性的指标［14-15］，本实验结果表明，干热前／后样品的Tmid值差异无统计学意义（P＞0.05），表明干热灭活对人纤维蛋白原热稳定性无影响。

人纤维蛋白原干热灭活效果及其对制品质量的影响程度，与纯化工艺、制剂处方、冻干参数密切相关。华兰生物工程股份有限公司研发的人纤维蛋白原采用低温乙醇沉淀纯化工艺，以氯化钠、枸橼酸钠、精氨酸、蔗糖、甘氨酸作为稳定剂，冻干后经100℃干热30 min，既能有效灭活病毒，提高制品安全性，又不影响制品质量。为使人纤维蛋白原适应干热灭活步骤，研究者可结合纯化工艺特点，优化确立制剂处方及冻干参数，在保证灭活效果的同时，稳定产品质量。