中药单体抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的研究进展

杨若琪，赵贵萍，王川东，王 静

(1.山东中医药大学 药学院，山东 济南 250355；2.云南中医药大学 中药学院，云南 昆明 650500；3.山东大学 微生物技术研究院，山东 青岛 266237)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)是一种常见的人类病原体,通常可以无症状地定植在人类的上呼吸道、皮肤和肠黏膜中,并且在大多数情况下很少对健康的个体造成严重的生命威胁[1]。但当人体因慢性皮肤病、伤口或手术干预而导致皮肤和黏膜屏障被破坏时,金黄色葡萄球菌可进入下层组织或血液，并引发感染。带有植入性医疗设备(例如外围和中央静脉导管)或免疫系统受损的人群特别容易受其感染[2]。金黄色葡萄球菌对抗生素产生的耐药性致使其治疗复杂化,是目前临床治疗的主要难题。

为了对抗金黄色葡萄球菌,人们在1959年引入了甲氧西林,然而仅2年后临床上就首次发现了抗甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)[3]。更为严重的是,所有植入的医疗器械都极易被金黄色葡萄球菌定植,进而发展形成生物被膜(biofilm)[4]。生物被膜是指包裹在自身产生的胞外基质(ECM)中的微生物聚集体，有研究显示：杀死生物被膜中细菌所需的抗生素用量比杀死浮游细菌所需的抗生素用量要高1 000倍[5]。这种抗性的增加主要归因于生物被膜基质的有限扩散或者排斥性,致使大多数药物渗透效果较差,从而减少了生物被膜内部细胞与抗菌药物的直接接触。此外,生物被膜内部细胞呈现出生长缓慢、代谢活力低的生理异质特性,也会限制并降低抗生素的功效,尤其是那些针对细胞活跃过程的抗生素[6]。金黄色葡萄球菌形成的生物被膜不仅对环境具有较强的适应性,而且还能够躲避宿主的先天性和适应性免疫系统的攻击，增加了植入物感染的持续性和反复性,为临床治疗带来了巨大的挑战[7]。

顽固的生物被膜一旦形成，将很难有效地根除,因此,一旦感染相关的金黄色葡萄球菌生物被膜，通常需要手术清创和延长抗菌治疗周期。除了常规的方案以外,新型的不同作用机制的预防或根除葡萄球菌生物被膜的策略也正被广泛采用。例如：分子干扰群体感应系统、降解生物被膜基质组分、噬菌体疗法、声电效应与光动力疗法、衍生修饰植入材料表面、将纳米颗粒作为载体输送抗生素药物或制备具有抗菌活性的金属纳米颗粒[8-9]。在临床实践中,现有药物对葡萄球菌生物被膜的作用效果并不理想,因此,抗金黄色葡萄球菌感染的新药研发也从未间断[10]。具有生物活性的天然产物，包括动、植物资源数千年来一直被广泛使用,时至今日仍然是新的潜在治疗制剂的最重要来源[11]。发源于中华大地的中医药是中华文明的珍贵宝藏,在全民健康中发挥着重要作用。一些来源于中药的单体化合物可以靶向作用于金黄色葡萄球菌的生物被膜,抑制其形成或分散已建立的成熟生物被膜,例如黄酮类化合物槲皮素[12]、山柰酚[13],苯丙素类化合物丁香酚[14]、肉桂醛[15]以及萜类化合物圆柚酮等[16],但它们作用的具体方式和相关的分子作用机制还有待更深入的研究。

1 金黄色葡萄菌的生物被膜简介

绝大多数微生物在自然环境中将细胞嵌入自身产生的ECM中,并附着在各种生物和非生物表面上进行生长繁殖,形成一类高度组织化和结构化的细胞群体结构,这种特殊化的结构即被称之为生物被膜。细菌生物被膜的ECM中富含多糖、蛋白、脂质和核酸等生物大分子[17-18]。对于金黄色葡萄球菌而言,其ECM则由多糖、海藻酸、胞外DNA及几种表面蛋白组成,并且各组分的含量在不同的分离菌株中呈现出一定的差异性[19]。虽然细菌生物被膜中的物质成分存在种属特异性,但是其形成过程的基本模型被广泛认为包括3个连续阶段：附着、成熟和分散[20]。在附着阶段,浮游细胞黏附在生物或非生物表面上,然后增殖成为微菌落。随着这些微菌落的发展,菌体细胞会向胞外分泌产生ECM作为构建生物被膜必不可少的空间三维支架。当达到特定的细胞密度后,一种启动ECM降解的机制就会被触发,释放出嵌入生物被膜内部的细胞,从而在远端部位进行分散并重启生物被膜的新一轮发育[21-22]。金黄色葡萄球菌也被认为与其他细菌具有相似的生物被膜发育阶段。最近,一种与荧光显微镜集成的孔板微流控系统(BioFluxTM1000 system)实时地评估了金黄色葡萄球菌生物被膜的发育过程,并将整个过程重新定义为5个阶段,包括：附着、繁殖、外流、成熟和分散[21](图1)。金黄色葡萄球菌生物被膜形成的机制非常复杂,涉及环境因素,群体感应,蛋白酶以及多种全局调节因子[8,23]。

图1 金黄色葡萄球菌生物被膜形成模型[21]Fig.1 Model of Staphylococcus aureus biofilm formation[21]

2 金黄色葡萄球菌生物被膜形成的调控机制

2.1 细胞间多糖黏附素(PIA)的依赖机制

PIA是葡萄球菌生物被膜的重要成分之一,也称为聚合N-乙酰基葡萄糖胺(PNAG)。葡萄球菌生物被膜的积累是由PIA介导的,而PIA的产生由细胞间黏附因子(Ica)操纵子编码的产物调节[24]。Ica基因座包括icaADBC4个功能基因和icaR调节基因。icaA和icaD基因分别编码具有N-乙酰氨基葡萄糖转移酶活性的跨膜酶,用于合成N-乙酰氨基葡萄糖聚合物,其在胞外多糖的产生中起着重要作用[25]。icaC基因的产物将N-乙酰氨基葡萄糖聚合物转移到细菌细胞的表面,而icaB基因的产物能够使该分子去乙酰化。icaR是一个阻遏基因,对ica的表达具有负调控的作用,当icaR突变后,icaADBC的表达将上调[26]。金黄色葡萄球菌也产生PIA,Ica操纵子存在于几乎所有金黄色葡萄球菌菌株中[27]。ica基因表达的下调是抑制生物被膜形成的一种作用机制,因此删除ica基因位点会阻碍PIA的产生和生物被膜的形成,使其成为治疗细菌生物被膜感染的一个潜在靶标[28]。

2.2 细胞表面蛋白(PIA非依赖机制)

尽管Ica基因座在生物被膜的发育中非常重要,但生物被膜还存在不依赖Ica的形成途径[29]。在初始黏附阶段,金黄色葡萄球菌通过细胞壁锚定蛋白(CWA)黏附到宿主组织周围的生物表面以及涂有血浆蛋白的非生物表面。识别黏附基质分子的微生物表面成分(MSCRAMMs)作为细菌表面蛋白,可以与人类基质蛋白结合,这与生物被膜形成的早期阶段有关[30]。MSCRAMMs主要包括葡萄球菌蛋白A(SpA)、纤连蛋白-结合蛋白(FnBPs)、生物被膜相关蛋白(Bap)、聚集相关蛋白(Aap) 和凝集因子(Clfs)等。它们大多数具有共同的细胞壁靶向基序(LPXTG),并通过转肽酶A(SrtA)锚定到细胞壁上,该酶可以催化表面蛋白与肽聚糖的五甘氨酸交联剂进行共价连接[31]。Archer等[29]研究表明：在不依赖Ica的生物被膜形成途径中,细胞间的黏附可以替代PIA介导的生物被膜的形成。

2.3 胞外DNA(eDNA)

eDNA来源于细菌的程序性死亡和裂解,在生物被膜的初始黏附阶段起连接作用,同时也是生物被膜的胞外基质的重要组成成分[32]。eDNA的释放促进了金黄色葡萄球菌生物被膜的形成,该过程主要由Cid、Lrg和Atl操纵子调控。在金黄色葡萄球菌中,细胞的死亡和裂解受Cid和Lrg操纵子的控制,它们编码蛋白的功能与孔蛋白(Holin)和孔蛋白拮抗蛋白(antiholin)类似,通过调节胞壁水解酶的活性,从而影响生物被膜的形成[33]。金黄色葡萄球菌的cidA基因在生物被膜发育过程中促进细胞裂解,而lrgAB基因抑制细胞裂解[34]。有研究显示：细胞的自溶作用对eDNA释放和生物被膜的形成是必要的[32]。自溶素基因atl可以通过促进细胞自溶来增加eDNA的释放。细胞溶解和eDNA的释放是金黄色葡萄球菌生物被膜形成复杂调控机制的另一个分支。

2.4 群体感应(QS)系统

革兰氏阳性菌在形成生物被膜的过程中通过QS系统传导细胞间的信息传递,因此QS系统控制着金黄色葡萄球菌生物被膜的形成和毒力因子的表达[35]。辅助基因调节(Agr)系统和LuxS/自诱导分子-2(AI-2)系统是葡萄球菌两种主要的QS系统。agr基因编码RNAⅡ和RNAⅢ,前者含有agrABCD4个基因,后者是一种自诱导肽。有研究显示：Agr系统通过上调胞外蛋白酶的表达,使生物被膜中的细胞从生物被膜结构中分离,从而抑制了生物被膜的形成[36]。luxS/AI-2系统对生物被膜的抑制作用与Agr系统相似,研究发现：LuxS/AI-2系统可以通过激活icaR来减少金黄色葡萄球菌生物被膜的形成[37]。Agr系统在毒力因子的表达中起着关键作用,使其成为一个潜在的治疗靶标[38]。

2.5 全局调控因子

全局调控因子主要包括葡萄球菌辅助调节因子(SarA)和转录因子SigB等,对金黄色葡萄球菌的基因表达和生物被膜形成具有全面的影响[39]。SarA是控制金黄色葡萄球菌毒力因子产生的重要调节元件,对于PIA的合成至关重要[40]。SarA可以增强ica操纵子的转录，从而促进金黄色葡萄球菌生物被膜的发育[41]。同时SarA也可以上调agr基因的表达,从而影响金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。有研究显示：金黄色葡萄球菌的sigB基因突变菌株通过下调编码耐热核酸酶的nuc基因的表达来促进生物被膜的形成[42]。SarA能够调控多种生物被膜形成相关基因的表达,是抑制生物被膜形成的关键靶标。金黄色葡萄球菌生物被膜形成调控网络见图2。

图2 金黄色葡萄球菌生物被膜形成调控网络[8]Fig.2 Regulatory network of Staphylococcus aureus biofilm formation[8]

3 抑制金黄色葡萄球菌生物被膜形成的中药单体

中药作为中华民族文化的瑰宝,其应用历史十分悠久。中药是天然存在的，或是经过特殊加工的植物、动物部位和矿物质。中药发挥作用的物质基础主要是其所含有的各种活性单体成分，因此，对于中药及其单体成分药理作用的研究也成了当今国内外学者研究的热点。中药具有来源广泛,价格便宜,毒副作用小等优点,符合现代社会倡导的“绿色”和“天然”的趋势[43]。有研究显示：由于中药及其单体成分降低了产生耐药性的可能,因此它们比合成衍生物更具有优势[44]。中药发挥作用的一大特色为中药的复方性,中药复方不仅仅是简单的几味中药药效的加和,而是多环节、多目标、多靶点的[45]。目前，中药复方对金黄色葡萄球菌生物被膜抑制作用的相关报道还比较少,因此，对于中药复方的进一步研究也是未来发展的重要趋势。

3.1 黄酮类化合物

黄酮类化合物在自然界中分布广泛,以唇形科、芸香科、姜科中存在较多。Lee等[12]的研究结果显示：槲皮素下调了icaA和icaD基因的表达,从而抑制了生物被膜的形成。Chen 等[46]研究发现：黄芩素能够阻断QS系统调控的细胞间信号的转导,从而下调了QS系统调节因子agrA和sarA的基因表达,最终阻碍了生物被膜的形成。Ming等[13]发现：山奈酚通过降低金黄色葡萄球菌SrtA的活性和黏附相关基因fnbA、fnbB、clfA、clfB的表达,抑制了生物被膜形成的初始黏附阶段,从而干扰了生物被膜的发育。

3.2 苯丙素类化合物

目前认为苯丙素类化合物通常包括简单苯丙素类、香豆素类和木脂素类,属于酚类化合物。Yadav等[14]研究发现：丁香酚在体外降低了sarA和icaD基因的表达,从而导致多糖的积累减少,抑制了细胞在生物被膜中的黏附作用,最终阻碍了生物被膜的形成,同时对已形成的生物被膜也有明显的根除作用。Wang等[47]的研究结果显示：厚朴酚可以通过抑制cidA基因，并诱导lrgAB基因的表达,减少eDNA的释放,从而阻碍生物被膜的形成。Jia等[15]研究了肉桂醛对生物被膜相关基因sarA表达的影响,结果表明：肉桂醛抑制了sarA的表达和金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。Bai等[48]发现：莽草酸可以通过干扰生物被膜形成的早期阶段来下调sarA基因的表达,但是对已形成的生物被膜并没有影响。

3.3 萜类化合物

萜类化合物通过异戊二烯法则进行分类,常见的单萜以及倍半萜类化合物在唇形科、芸香科以及菊科中大量存在,二萜类化合物则集中分布在五加科、大戟科、茜草科中。Farha等[16]的研究结果显示：圆柚酮可以下调icaA、sarA和agrA基因的表达,降低胞外多糖的合成,从而抑制生物被膜的形成；同时还发现圆柚酮可以使已成熟的生物被膜的平均厚度减小,生物被膜内细胞的存活能力也明显降低。戴雨芸等[49]研究了香芹酚对金黄色葡萄球菌生物被膜的作用机制,发现香芹酚通过减少PIA的合成,可显著抑制icaA、sarA和cidA基因的表达,对金黄色葡萄球菌生物被膜的形成与根除已成熟的生物被膜都有一定的效果。

3.4 醌类化合物

醌类化合物在植物中的分布也非常广泛,常见的如：蓼科植物大黄、唇形科植物丹参等均含有醌类化合物。刚果红可以与细菌生物被膜表面PIA反应,导致菌落变黑。Xiang等[50]发现：芦荟大黄素以剂量依赖性的方式显著减少了黑色菌落的数量,该结果表明芦荟大黄素可以减少细胞表面PIA的积累,从而减弱了生物被膜的形成能力。

3.5 鞣酸类化合物

鞣酸类化合物通常是指一种特殊的植物多元酚,许多中草药例如：五倍子、大黄、地榆中均发现了较高含量的鞣酸类化合物。Liu等[51]的研究结果显示：没食子酸通过上调icaR并下调icaA和icaD的表达来调节Ica操纵子,从而减少了多糖黏液的产生并抑制了生物被膜的形成,但是没食子酸对icaB和icaC基因没有明显的调节作用。

中药单体的抗生物被膜分子机制见表1。

表1 中药单体的抗生物被膜分子机制

4 结论

生物被膜的形成是金黄色葡萄球菌产生耐药性的原因之一。生物被膜的结构使细菌对抗生素具有更强的抵抗力,从而增加了从宿主根除病原体的难度。近年来,随着植入医疗设备的广泛使用,葡萄球菌可以通过形成生物被膜进行定植。金黄色葡萄球菌生物被膜对多种抗生素耐药性的增强，对人类健康构成了重大威胁。金黄色葡萄球菌形成生物被膜的能力与慢性感染的持续存在息息相关。与浮游细菌相比,生物被膜下的细菌由于缺少氧气和营养物质,其生长代谢速度迟缓,对外界刺激的敏感性降低,很难被彻底清除,这也是生物被膜感染易反复发作的原因之一。

常规抗生素治疗在抑制和消除生物被膜感染方面效果甚微。与化学合成药物相比,中药单体成分由于不易产生耐药性而具有独特的优势。许多中药单体成分在多种生物被膜模型中对金黄色葡萄球菌表现出抗生物被膜活性。除此之外,分子对接方法已成为计算机辅助药物研究领域的一项重要技术。在进行传统生物学测定之前,将中药中的药物分子与金黄色葡萄球菌中常见靶点蛋白之间的相互作用进行预测评估,可以有效地缩小筛选的范围、提高命中率、降低药物研发成本。尽管许多中药单体具有治疗生物被膜相关感染的巨大潜力,但它们的某些作用机制仍不清楚。因此，尚需开展深入研究,揭示其具体作用方式及关键靶点,结合物理化学手段,进一步阐明其作用机制,可以为抗生物被膜天然药物的研发提供新的思路。