Gm4CL2基因对拟南芥和紫花苜蓿耐铝性的影响

2022-10-24林涛张立娇韩蓉蓉玉永雄蒋曹德

草业学报 2022年10期

林涛，张立娇，韩蓉蓉，玉永雄，蒋曹德*

（1.西南大学动物科学技术学院，重庆市草食动物资源保护与利用工程研究中心，重庆 400715；2.广安市饲料工业管理站，四川广安 638000）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是世界公认的蛋白质丰富的豆科牧草，被誉为“牧草之王”，为现代畜牧业生产中不可或缺的蛋白饲料。近年，南方地区草食畜牧业发展迅速，对紫花苜蓿的需求剧增。但是，南方地区土壤多为酸性，其中的铝离子（主要为Al3+）对紫花苜蓿产生严重的铝毒危害［1-2］。而且，苜蓿属植物缺乏耐铝遗传物质，采用常规育种方法培育紫花苜蓿耐铝品种缺乏可行性［3-4］。因此，借助分子育种和转基因技术导入耐铝基因已成为培育紫花苜蓿耐铝毒品种的必然选择。

酸性土壤生长植物进化出两种耐铝机制，一种是内部耐受机制，包括细胞内有机酸的螯合、细胞区室化等；另一种为外部排斥机制，包括细胞壁的固定、根尖有机酸的分泌等［1-2］。目前发现，Al3+诱导根尖分泌的有机酸包括草酸、苹果酸和柠檬酸，但是大豆（Glycine max）、柱花草（Stylosanthes guianensias）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）、烟草（Nicotiana tabacum）、玉米（Zea mays）、小麦（Triticum aestivum）和大麦（Hordeum vulgare）等众多耐铝植物的研究证实根尖分泌柠檬酸是植物解铝毒的关键机制［1-2］。作为Al3+进入原生质体的第一道屏障，细胞壁在植物铝毒中的作用近年来得到广泛的关注。研究发现根细胞壁木质素含量与植物耐铝性密切相关［5］，尤其木质素合成途径关键酶4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumarate：coenzyme A ligase，4CL）已被证明在生物和非生物胁迫、机械损伤抗性等生物过程中具有重要作用［6-7］。4CL催化肉桂酸及其衍生物生成相应的硫酯，是连接木质素、黄酮、软木脂、芪类、香豆素和细胞壁结合的酚类等前体与苯丙烷类代谢各个分支途径的纽带［5］。杨树（Populus）、烟草和拟南芥等植物的研究揭示4CL基因家族被病原体感染、紫外线辐射、干旱胁迫等外界刺激诱导表达，4CL基因催化产生的次生代谢产物在生长、发育和环境互作中具有重要的作用［5，8］。尽管4CL基因已被证明在生物和非生物胁迫中具重要作用，但与柠檬酸分泌相关的耐铝功能研究还未见报道。

大量文献报道，大豆品种“丹波黑”（G.maxcv.Tamba）适应酸性土壤生长，Al3+诱导其根尖分泌柠檬酸是其主要的解铝毒机制［1-2］。作者前期利用RNA-seq技术检测到丹波黑大豆Gm4CL2基因被Al3+诱导表达，但是在Al3+胁迫和非胁迫下未检测到紫花苜蓿同源基因的表达。本研究进一步克隆Gm4CL2全长编码序列，揭示其在Al3+胁迫下对细胞壁结构、柠檬酸分泌以及紫花苜蓿耐铝性的影响，以期鉴定Gm4CL2的耐铝功能以及为基于柠檬酸分泌相关基因培育紫花苜蓿耐铝品种积累育种材料。

1 材料与方法

1.1 植物材料与培养

丹波黑大豆种子由日本京都大学提供；拟南芥Col-0和渝苜1号紫花苜蓿种子由本实验室保存。于2020年3月，使用1% NaClO对丹波黑大豆和紫花苜蓿种子消毒20 min，用双蒸馏水洗涤3次后于湿润滤纸上孵育2 d（n=3）。发芽后，将幼苗移栽到1/2霍格兰营养液（pH 6.0）于25℃/20℃（昼/夜）200 μmol·m-2·s-1恒光条件下培养。将种子灭菌后播种于1/2 MS琼脂培养基上，选取长势一致的野生型及Gm4CL2过表达植株在1/2的霍格兰营养液中进行水培。

1.2 Gm4CL2基因克隆与序列分析

使用RNAiso Plus（Takara，大连）提取丹波黑大豆2周幼苗根尖（0～2 cm）总RNA，Prime ScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser（Takara，大连）反转录制备cDNA模板。根据大豆基因组序列设计Gm4CL2全长编码序列引物Gm4CL2-F和Gm4CL2-R（表1），cDNA为模板，按照PrimeSTAR®Max DNA Polymerase（Taraka，大连）说明书配制PCR扩增体系。PCR反应程序：94℃5 min；94℃10 s，58℃2 min；72℃30 s，32个循环；72℃10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测后，利用凝胶回收试剂盒（OMEGA，美国）进行回收，并与pMD19-T（Taraka，大连）载体连接后转化大肠杆菌DH5α，挑取阳性菌落送商业测序（深圳华大基因股份有限公司，重庆）。获得的序列在NCBI进行Blastx比对，挑选双子叶植物4CL同源蛋白质序列采用MEGA 7.0进行多序列比对，并用邻接法［8］构建系统发育树。

表1 引物序列信息Table 1 Primer information

1.3 Gm4CL2过表达载体的构建、亚细胞定位及遗传转化

以1.2部分含有PMD19T-Gm4CL2阳性大肠杆菌为模板，利用引物Gm4CL2-F和Gm4CL2-R扩增的Gm4CL2的全长编码序列。XbaⅠ、SmaⅠ分别双酶切PMD19T-Gm4CL2和pBI121-eGFP，回收产物用T4连接酶于16℃连接过夜，并转化DH5α。菌落PCR检测后挑取阳性菌落，利用Plasmid Mini Kit I（OMEGA）提取质粒，冻融法［8］转化感受态农杆菌LBA4404，利用浸花法［9］遗传转化野生型拟南芥Col-0。对于紫花苜蓿遗传转化，上述方法构建过表达载体pCAMBIA1300-35S-Gm4CL2-mCherry，按照Wei等［8］采用农杆菌GV3101介导的叶盘法导入紫花苜蓿渝苜1号高频再生15号植株［10］。简而言之，剪取紫花苜蓿无菌苗的叶片（0.5 cm×0.5 cm），于预培养基上培养24 h；取农杆菌pCAMBIA1300-35S-Gm4CL2-mCherry侵染紫花苜蓿叶片30 min；吸干菌液，置于共培养基2 d，移至分化培养基（培养基每2周更换一次），至分化出幼苗；在出芽培养基上用LUYOR-3415RG荧光蛋白激发光源筛选得到带红色荧光的芽点，并进行生根培养，在生根培养基上通过LUYOR-3415RG荧光蛋白激发光源筛选带红色荧光的Gm4CL2过表达阳性植株。

对于亚细胞定位，XbaⅠ、SmaⅠ分别双酶切PMD19T-Gm4CL2和pHBT-GFP-NOS，构建pHBT-Gm4Cl2-eGFP-NOS载体，瞬时转化拟南芥原生质体。取未抽苔的拟南芥叶片制备原生质体，以pHBT-eGFP-NOS&PMrk为细胞膜定位标记，以pHBT-eGFP-NOS为空载体，取pHBT-Gm4Cl2-eGFP-NOS质粒，加入制备好的原生质体中，23℃弱光，孵育16 h，于激光共聚焦显微镜（LSM 800，Zeiss，德国）下观察。

1.4 Gm4CL2过表达拟南芥阳性植株的筛选

于2020年3月，将拟南芥种子在含有卡那霉素（kanamycin，Kn）的培养基上培养，挑选在培养基上长势一致的拟南芥进行土培（n=3）。生长两周后收集叶片组织，提取DNA与RNA，并反转录cDNA；分别以DNA和cDNA为模板，按照1.2部分的方法利用引物Gm4CL2-F、Gm4CL2-R进行PCR扩增。将收获的T0种子放置含有50 mg·L-1Kn的1/2 MS培养基上培养，收集阳性植株种子为T1代，再将T1代种子进一步筛选T2代，最后筛选出T3代种子。

1.5 Real-time PCR分析

取水培2周长势一致的丹波黑大豆幼苗，在0.5 mmol·L-1CaCl2溶液（pH 4.5）中预培养12 h，然后在加入0（对照）、25、50、75、100 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）溶液中培养24 h（用于检测不同Al3+浓度对Gm4CL2表达的影响），或者在50 μmol·L-1AlCl3的条件下分别处理0、3、6、9、12、15、18、21、24、27、30、33、36 h（用于检测不同铝处理时间对Gm4CL2表达的影响），或者在AlCl3、MnCl3、FeCl3、GaCl3和LaCl3（浓度均为50 μmol·L-1）条件下分别处理24 h［11］（用于检测不同金属离子对Gm4CL2表达的影响），每个处理3个重复，每个重复15株。取0～2 cm根尖组织，液氮速冻后于-80℃保存。为了检测不同组织和根部不同区段Gm4CL2表达的差异，将预培养的植株在50 μmol·L-1AlCl3处理24 h，取0～2 cm、2～4 cm和4～6 cm的根部组织。对于拟南芥Gm4CL2、AtMATE、AtSTAR1和AtSTAR2基因表达检测，在50 μmol·L-1AlCl3处理24 h和非处理条件下收集T3代水培2周的根、茎、叶（0～2 cm）组织。采用RNAiso Plus和Prime ScriptTMreagent Kit with gDNA Eraser（Taraka，大连）分别进行RNA提取与反转录反应；以表1中各基因引物，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ（Taraka，大连）说明书进行real-time PCR扩增；以大豆18S rRNA基因或者拟南芥β-actin为内参提取，采用2-△△Ct方法计算基因的相对表达量［12］。

1.6 拟南芥和紫花苜蓿耐铝性分析

1.6.1根伸长量测定将野生型和T3代Gm4CL2过表达拟南芥种子用7%次氯酸钠溶液消毒灭菌10 min后，无菌水清洗3次置于1/2 MS培养基（pH 5.8）培养3 d萌发。然后，将拟南芥幼苗移入含有50、100、150、200 μmol·L-1AlCl3的1/2 MS培养基中生长，每个处理6个重复，每个重复15株。14 d后直尺测量根长，计算根相对伸长率（铝胁迫根的伸长量/无铝胁迫根的伸长量×100%）。

选取根部长势一致的野生型和Gm4CL2过表达紫花苜蓿（主根长约3～4 cm）3个株系，每株系5个重复，每个重复15株，于0.5 mmol·L-1CaCl2（pH 4.5）预处理12 h后，分别加入0和15 μmol·L-1AlCl3（均含0.5 mmol·L-1CaCl2，pH 4.5）处理24 h后，测量第1、7天的主根长。

1.6.2铝含量测定选取根生长一致的野生型和Gm4CL2过表达拟南芥在50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）条件下处理24 h，以非处理组为对照，每个处理5个重复，每个处理15株。对于野生型和Gm4CL2过表达紫花苜蓿采用15 μmol·L-1AlCl3（0.5 mmol·L-1CaCl2，pH 4.5）处理24 h［10］。取根尖烘干至恒重，粉碎后取2 g加入10 mL浓硝酸静置过夜；加60%高氯酸3 mL，加热至沸后冷却；去离子水过滤定容，采用原子荧光光度计（Lumina 3400，Aurora，加拿大）测定样品铝含量。

1.6.3伊文思蓝和铬天青S染色将0和50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）处理24 h的野生型和T3代拟南芥种子用超纯水冲洗15 min，幼苗根部分别浸入0.25%的伊文思蓝和0.1%铬天青S染色液中染色15 min，超纯水冲洗15 min后用体视镜拍照，3个重复。

将野生型和Gm4CL2过表达紫花苜蓿（主根长约3 cm）在0、15 μmol·L-1AlCl3的溶液（0.5 mmol·L-1CaCl2，pH 4.5）中处理24 h后，按照上述方法进行伊文思蓝染色。

1.7 柠檬酸分泌量测定

0和50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）分别处理野生型和T3代拟南芥水培2周幼苗，或者15 μmol·L-1AlCl3（0.5 mmol·L-1CaCl2，pH 4.5）处理野生型和Gm4CL2过表达紫花苜蓿水培2周幼苗，每个处理3个重复，每个重复15株。24 h后，测量根重并收集处理液体，用柠檬酸（citric acid，CA）ELISA试剂盒（上海贝博生物科技公司）测定处理液中的柠檬酸含量。

1.8 活性氧与抗氧化能力检测

选取根生长一致的野生型和Gm4CL2过表达拟南芥在50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）条件下处理24 h，每个处理3个重复，每个处理15株。取0～2 cm根尖，按照活性氧（reactive oxygen species，ROS）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测定试剂盒说明书（上海优选试剂有限公司），采用DCFH-DA荧光探针和分光光度法［11］分别测定ROS、MDA含量以及POD、SOD活性。

1.9 细胞壁成分分析

选取根生长一致的野生型和Gm4CL2过表达拟南芥在50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5，0.5 mmol·L-1CaCl2）条件下处理24 h，取0～2 cm根尖，每个处理3个重复，每个重复15株。根据木质素和果胶含量测定试剂盒说明书（上海优选试剂有限公司），将样品烘干、粉碎、过筛后加入各试剂混合，放入96孔板中，于280 nm处测吸光度值A，木质素和果胶（mg·g-1FW）=0.147×（A样品-A空白-0.0034）/样本质量×稀释倍数。采用超高效液相色谱串联质谱法［13］测定拟南芥木质素途径中小分子含量（上海优选试剂有限公司）。基于METLIN（metabolite link）数据库，对分级和二级光谱进行定性分析。使用Analyst 1.6.3进行定性和定量分析。采用BCA蛋白定量试剂盒（上海优选生物技术有限公司）测定可溶性蛋白含量。

1.10 数据分析

采用Excel 2016整理数据，表示为平均值±标准偏差（mean±standard deviation，SD），用SPSS 20.0软件对数据进行单因素方差分析与Tukey多重比较。

2 结果与分析

2.1 Gm4CL2基因的克隆与序列分析

以丹波黑大豆根尖cDNA为模板，PCR扩增并克隆出Gm4CL2基因，全长cDNA为1668 bp，编码555个氨基酸（GenBank No.MW148764）。通过Blastx比对，从NCBI中选择了16个双子叶植物46个同源蛋白序列（图1）。进化树分析结果表明，这些4CL蛋白可聚成3组，即GroupⅠ、Ⅱ、Ⅲ。其中在GroupⅠ中，Gm4CL2与大豆4CL4和野生大豆4CL2聚为一个亚类，为双子叶植物中的Ⅰ类4CL。序列分析表明，Gm4CL2包含两个在整个4CL基因家族中保守的基序，即AMP（adenosine monophosphate）结合基序和COA（coenzyme A）结合位点。

2.2 铝特异性诱导Gm4CL2基因的表达

通过real-time PCR方法检测了不同浓度和不同时间Al3+处理下丹波黑大豆根尖Gm4CL2表达的变化。50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）处理24 h，Gm4CL2在0～2 cm的根尖组织中表达量最高（图2A，B；P＜0.05）。在50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）处理24 h条件下，Gm4CL2的表达量显著高于Fe3+、Mn3+、Ga3+和La3+处理的植株（图2C）；0～2 cm根尖组织Gm4CL2表达量也显著高于2～4 cm和4～6 cm的根尖组织（图2D，P＜0.05）。

2.3 过表达Gm4CL2基因提高拟南芥的耐铝性

为了探讨Gm4CL2的耐铝功能，本研究利用农杆菌介导遗传转化拟南芥，利用PCR的方法检测到12株T3代拟南芥的基因组中含有Gm4CL2基因，并且该基因在这些植株中得到表达。随机选择3个T3株系，检测了不同浓度AlCl3处理对Gm4CL2过表达拟南芥耐铝性的影响。结果表明，Gm4CL2蛋白亚细胞定位于拟南芥根尖细胞质膜（图3A）。在50、100和150 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）胁迫下，虽然Gm4CL2过表达植株和野生型拟南芥根的生长均受到抑制，但是Gm4CL2过表达株系的根相对伸长率显著大于野生型（图3B，C，P＜0.05）。在50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）处理的条件下，Gm4CL2过表达植株根系的伊文思蓝和铬天青S染色也低于野生型（图4A），3个Gm4CL2过表达植株根尖Al3+含量分别为野生型的0.61、0.65和0.66倍（P＜0.05，图4B）。

2.4 过表达Gm4CL2提高拟南芥的抗氧化能力

铝胁迫导致植物脂质过氧化，产生的大量活性氧损害植物机体［14］。本研究采用DCFH-DA测定了在AlCl3胁迫下Gm4CL2过表达拟南芥和野生型拟南芥活性氧水平的变化。50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）处理24 h后，Gm4CL2过表达植株根尖ROS水平比野生型显著降低（P＜0.05），而且与非处理植株根尖ROS水平无显著差异（P＞0.05，图5A）。进一步检测了Gm4CL2对拟南芥抗氧化能力的影响，在非胁迫和胁迫条件下，Gm4CL2过表达拟南芥根尖POD、SOD活性比野生型均有显著的提高（P＜0.05），其中AlCl3处理植株分别为野生型的1.61、1.53、1.40倍以及1.28、1.39、1.43倍（图5B，C）。虽然在非胁迫条件下Gm4CL2过表达植株和野生型植株其根尖MDA没有显著差异（P＞0.05），但是Al3+处理显著降低了Gm4CL2过表达植株根尖MDA含量，分别为野生型根尖的0.75、0.67和0.75倍（P＜0.05，图5D）。

2.5 Gm4CL2对拟南芥根部细胞壁成分的影响

首先测定了野生型和Gm4CL2过表达拟南芥根尖木质素和果胶的含量。在非Al3+胁迫下，Gm4CL2过表达拟南芥根尖木质素含量与野生型没有显著差异（P＞0.05），但是Al3+胁迫引起Gm4CL2过表达植株木质素含量显著降低（P＜0.05，图6A）。另外，在Al3+胁迫和非胁迫下，Gm4CL2过表达拟南芥根尖果胶含量均显著降低（P＜0.05，图6B）。

其次，为了考察Gm4CL2对木质素合成途径的影响，利用高效液相色谱测定了拟南芥根尖4CL代谢底物的含量。野生型和Gm4CL2过表达植物根系检测到4-香豆酸、咖啡酸和阿魏酸，但是未能检测到没食子酸、儿茶素、芦丁、木犀草素。在非胁迫下，Gm4CL2过表达植株根尖4-香豆酸、咖啡酸和阿魏酸含量比野生型显著降低（P＜0.05，图6C～E）。在Al3+胁迫下，3个Gm4CL2过表达株系根尖4-香豆酸比野生型分别提高37.7%、38.5%和32.5%，但是咖啡酸和阿魏酸分别降低49.4%、43.6%、30.8%以及98.0%、95.5%、94.1%（P＜0.05，图6D，E）。在非胁迫下，Gm4CL2过表达植株可溶质蛋白比野生型植株显著降低（P＜0.05），但是在Al3+胁迫下，两者没有显著差异（P＜0.05，图6F）。

2.6 Gm4CL2促进拟南芥根尖柠檬酸的分泌以及铝胁迫应答基因的表达

根尖分泌柠檬酸鳌合Al3+是丹波黑大豆、拟南芥和柱花草等植物重要的耐铝机制［2-3，7］，因此分析了Gm4CL2与柠檬酸分泌相关的功能。50 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）处理后，Gm4CL2过表达拟南芥根尖柠檬酸分泌量显著高于野生型（P＜0.05），3个T3株系分别达到野生型的1.66、1.61和1.48倍（图7A）。此外，在非胁迫条件下，Gm4CL2过表达植株根尖柠檬酸通道蛋白基因（AtMATE）表达与野生型没有显著差异（P＞0.05），但是AlCl3处理显著上调了Gm4CL2过表达植株根尖AtMATE的表达量（P＜0.05，图7B）。

前期文献报道了水稻（Oryza sativa）的OsSTAR1和OsSTAR2/ALS3能够减少Al3+在细胞壁中的积累和损伤［2-3］，因而进一步检测了Gm4CL2对这两个基因表达的影响。结果显示：在Al3+胁迫下，Gm4CL2过表达植株根尖AtSTAR1表达量比野生型均显著提高（P＜0.05，图7C）；Gm4CL2过表达植株根尖AtSTAR2表达量在非胁迫下与野生型没有显著差异（P＞0.05），Al3+处理显著上调Gm4CL2过表达植株该基因的表达量（P＜0.05，图7D）。

2.7 Gm4CL2提高紫花苜蓿的耐铝性与生物量

利用基因组PCR和RT-PCR筛选到3株Gm4CL2表达量较高的渝苜1号紫花苜蓿阳性植株（图8A）。根据作者前期研究报道［10］，采用野生型渝苜1号紫花苜蓿能够耐受的15 μmol·L-1AlCl3（pH 4.5）对这些阳性株系进行胁迫处理。结果表明，Gm4CL2过表达紫花苜蓿根相对伸长率和根尖柠檬酸分泌量较野生型显著提高（P＜0.05，图8B，C），其根尖伊文思蓝着色和Al3+含量降低（P＜0.05，图8D，E）。虽然Al3+胁迫下转基因和野生型植株根尖木质素含量没有显著差异（P＞0.05，图8F），但是在胁迫和非胁迫下Gm4CL2过表达植株生物量显著高于野生型（P＜0.05，图8G）。

3 讨论

4CL蛋白家族能催化合成4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸和芥子酸对应的辅酶A硫酯，然后参与苯丙烷途径合成木质素和可溶性代谢物的生物合成，是控制碳固定途径的关键酶［5，8］。4CL基因在木质素的形成和盐、干旱胁迫中的重要作用在拟南芥、水稻、玉米、大豆、烟草和棉花（Gossypium）等植物中得到广泛的研究［8，15-17］。但是，除Liu等［13］探讨了4CL4基因对水稻耐铝性的影响外，关于4CL基因的耐铝功能还没有其他的研究报道。本研究基于前期丹波黑大豆在Al3+胁迫前后的转录组数据，克隆了Gm4CL2基因的全长cDNA序列。

本研究发现Al3+特异性诱导Gm4CL2在丹波黑大豆0～2 cm根尖组织表达（图2），Al3+胁迫处理造成Gm4CL2过表达株系根相对伸长率和生物量均高于野生型（图3），但是根尖Al3+含量低于野生型（图4A）。在水稻中，Liu等［13］也报道了Os4CL4具有减轻Al3+对根伸长的抑制作用。另一方面，在铝等胁迫下，ROS刺激产生大量的MDA，造成膜流动性降低和膜功能损伤，因此MDA水平指示着衡量植物细胞膜脂过氧化程度［18-19］。植物抗氧化系统利用抗氧化酶（POD和SOD等）负责清除细胞ROS，并提高植物耐铝性［20］。在Gm4CL2过表达拟南芥中，Al3+胁迫处理引起其根尖ROS和MDA水平下降，同时POD和SOD活性提高（图5），这些结果与水曲柳（Fraxinus mandshurica）Fm4CL2和4CL-like 1的抗氧化效应相一致［15，21］，进一步证实了Gm4CL2的耐铝功能。

目前从拟南芥、水稻、毛白杨（Populus tomentosa）和大豆等众多植物中鉴定的4CL基因家族分为3类：I类主要包括拟南芥、水曲柳的4CL1、2和4，它们与木质素的生成有关［22-23］；拟南芥At4CL3及杨树Pto4CL2等归为Ⅱ类，该基因激活4-香豆酸作为查耳酮合成酶的底物，参与类黄酮等苯丙化合物的生物合成；其他含有与4CL相同的保守基序和具有高度相似性的被归类为4CL-like［16］。本研究数据表明，丹波黑大豆Gm4CL2为I类，且保留有4CL蛋白高度保守的基序（motif）：AMP结合功能域（motif I）和BoxⅡ（motifⅡ）（图1），这显示Gm4CL2参与木质素合成的调控。进一步发现Al3+特异性诱导Gm4CL2在丹波黑大豆根尖组织表达（图2）；在铝胁迫下Gm4CL2过表达拟南芥根尖木质素含量低于野生型（图6）。Liu等［13］也发现4CL4及其上游肉桂酸羟化酶基因C4H2的突变降低了铝胁迫下水稻根和叶的木质素含量，提高了水稻的耐铝性。然而，相关文献报道杨树Pto4CL1、水曲柳Fm4CL2和棉花Gh4CL7基因在盐和干旱胁迫下增加木质素的含量［15，23］。这些结果说明4CL耐铝的功能途径与耐盐和耐旱不同，Gm4CL2引起的木质素的降低有利于植物对铝毒的抗性。

根尖细胞壁是铝毒的首要靶标，也是铝积累的主要部位［5］。植物细胞壁中的果胶羧基带负电荷，为Al3+结合的主要位点［5］。本研究的数据表明，Gm4CL2通过降低根尖果胶含量提高了拟南芥对铝毒的抗性（图6）。与上述结果不同，Gm4CL2提高了拟南芥4-香豆酸的含量（图6），这与水稻Os4CL4和杨树Pto4CL1研究结果一致［13，22］。实际上，最近的研究表明半纤维素也是拟南芥根尖Al3+积累的主要位点；阿魏酸和4-香豆酸可以通过酯键连接到半纤维素阿拉伯木聚糖或葡萄糖醛基阿拉伯木聚糖的阿拉伯糖侧链的C5碳上，它们通过增加半纤维素的交联减少Al3+与细胞壁的结合［19］。尤其Wohl等［17］报道金鱼藻（Anthoceros agrestis）4CL催化其底物活性大小依次降低的顺序为：异丙酸、4-香豆酸、咖啡酸、阿魏酸、肉桂酸，Liu等［13］也证实了Os4CL4对4-香豆酸、阿魏酸高度的亲和性。以上结果说明，在Al3+胁迫下Gm4CL2过表达造成4-香豆酸的积累，4-香豆酸与半纤维素交联造成Al3+与细胞壁结合能力降低，从而增强植株的耐铝性。

本研究一个新的重要发现在于Gm4CL2提高了拟南芥在铝胁迫下根尖AtMATE的表达与柠檬酸的分泌（图7）。证据表明，根尖分泌柠檬酸鳌合Al3+是大豆、拟南芥、烟草、玉米、小麦和大麦等众多耐铝植物解铝毒最为有效的机制之一［2-3］。前期研究通过药理学等方法明确了柱花草根尖柠檬酸转运体MATE在Al3+诱导柠檬酸分泌中的重要作用［10，24］。这些结果显示了Gm4CL2与柠檬酸分泌相关的耐铝功能。另一方面，STAR1和STAR2分别含有ATP结合盒（ABC）转运体的核苷酸结合结构域和跨膜结构域，它们形成复合体转运UTP-葡萄糖参与细胞壁的修饰，掩盖Al3+结合位点［2-3］。Gm4CL2提高拟南芥株系AtSTAR1和AtSTAR2的表达（图7）进一步证实了该基因参与细胞壁的修饰。但是，Gm4CL2对AtMATE、AtSTAR1和AtSTAR2调控等耐铝的分子机制有待进一步研究。

前期研究报道紫花苜蓿在3～5 μmol·L-1AlCl3处理24 h后，根伸长明显受阻［10，25］。渝苜1号紫花苜蓿是在南方的酸性土壤上选育出来的，能够耐受低于15 μmol·L-1AlCl3的胁迫，但是我国南方酸性土壤中游离铝离子浓度平均在20 μmol·L-1左右［10］，渝苜1号紫花苜蓿耐铝性需要进一步提高。虽然研究人员在鉴定植物耐铝机制、利用分子育种和转基因技术导入耐铝基因提高紫花苜蓿耐铝性方面进行了一些尝试，但是目前的研究主要集中在CS和MATE等与柠檬酸合成和分泌相关的单个下游基因［2，10］，未考虑其他途径和多个基因的作用，对于改善紫花苜蓿等植物的耐铝性效果不佳。本研究发现，转Gm4CL2基因紫花苜蓿比野生型具有较强的耐铝性；在铝胁迫下，转基因植株木质素含量与野生型没有差异，但是生物量提高（图8）。由于苜蓿干物质的消化率与木质素的含量极显著负相关，木质素含量过高会降低紫花苜蓿品质［26］，因此Gm4CL2可用来提高紫花苜蓿的耐铝性，有望在不改变牧草品质的基础上提高酸性条件下紫花苜蓿的产量。