生草对关中地区有机猕猴桃园土壤养分及细菌群落的影响

靳旭妹，王莹莹，刘崇义，陈新义，龙明秀，何树斌

（西北农林科技大学草业与草原学院，陕西杨凌 712100）

有机农业（organic agriculture）是指遵循自然规律和生态学原理，协调种植业和养殖业的平衡，在生产中不采用基因工程获得的生物及其产物，不使用化学合成的农药、化肥、生长调节剂、饲料添加剂等，采用一系列可持续发展的农业技术以维持持续稳定的农业生产体系的一种农业生产方式［1］。有机农业是生态友好型农业［2］，其为应对目前农业发展面临的诸多问题提供了有效途径，得到了国家的积极推广［3］。

近年来，我国猕猴桃（Actinidia chinensis）栽培面积和产量均位居世界第一位，而陕西省是我国乃至世界猕猴桃最大的产区［4-5］。近年来，陕西猕猴桃施肥不增产的情况普遍存在，极大挫伤了果农种植的积极性［6］。果园传统的清耕管理方式劳动强度大，土壤保水、保肥能力低，肥料投入成本高，而且造成冬春季节土壤裸露［7］。因此，需要施加合理的果园土壤管理模式，促进猕猴桃种植业增产增收。

果园生草是指对果园实施全园或行间生草覆盖，是一种先进果园土壤耕作管理模式，能促进果品的优质可持续生产。我国引入果园生草措施已近40年，对生草果园小气候、土壤的物理、化学和生物学特性，以及果实产量和品质的变化等开展了较多研究［8-9］。与清耕模式相比，果园生草有利于构建良好的果园生产体系、改善果园环境、提高果园生产力［10-11］。目前，该模式已在苹果（Malus domestica）园［12-13］、柑橘（Citrus reticulata）园［14］、葡萄（Vitis vinifera）园［15］等果园中得到应用。研究表明，生草可提高土壤有机质［16］、酶活性［17-18］，增加土壤微生物群落多样性［19-20］。同时，果园生草可有效控制杂草生长［21］、降低生产成本，提高果园产出［22-23］，是实现果树产业提质增效及农业可持续发展的有效途径之一［8］。果园生草栽培有人工生草和自然生草两种模式，自然生草可以改善土壤理化性状，增加碳、氮含量［24］，但是自然生草生长旺盛，容易与果树争水争肥［25］，且存在恶性杂草，因此有必要选择适宜关中地区猕猴桃园的草种进行人工生草，人工生草宜选择覆盖率较高的草种［26-27］。因此，本研究针对关中地区有机猕猴桃园在果实采摘后土壤处于空闲、有害杂草较多等现状，遵循有机果园的发展理念，评估不同草种在关中地区有机猕猴桃园越冬率、生长情况，并测定不同生草处理对果园耕层土壤含水量、pH、有机质、微生物碳氮、酶活性及土壤细菌群落结构的影响差异，筛选出适宜关中地区有机猕猴桃园种植的草种或组合，为关中地区有机猕猴桃园生产提供理论依据及技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

本试验基地位于陕西省杨凌示范区五泉镇上湾村百恒有机猕猴桃园（34°14′-34°20′N，107°59′-108°08′E），海拔为540.1 m，气候温和（东亚暖温带半湿润半干旱气候），年均气温12.9℃，年均降水量635.1 mm。该猕猴桃园果树为8年生的“翠香”品种，按“T”形架栽培，株行距6.0 m×3.8 m。该果园自然生草处理的秋季杂草群落为阿拉伯婆婆纳（Veronica persica）、齿果酸模（Rumex dentatus）、荠菜（Capsella bursa-pastoris）、打碗花（Calystegia hederacea）、猪殃殃（Galium aparine）和花叶滇苦菜（Sonchus asper）等。

1.2 试验材料

供试生草草种为多年生黑麦草（Lolium perenne）、毛苕子（Vicia villosa）、草木樨（Melilotus officinalis）、白三叶（Trifolium repens）和鼠茅草（Vulpia myuros）。

1.3 试验方法

1.3.1试验设计 本研究于2020年9月开始播种试验，试验设3种豆禾混播，多年生黑麦草+毛苕子混播（Mode 1）、多年生黑麦草+草木樨混播（Mode 2）、多年生黑麦草+白三叶混播（Mode 3）及禾本科鼠茅草单播（Mode 4），以自然生草为对照（CK），每个处理重复3次，共15个处理。采用随机区组设计，每小区面积为12.0 m×4.4 m。播种量为：多年生黑麦草22.5 kg·hm-2，毛苕子75.0 kg·hm-2，草木樨15.0 kg·hm-2，白三叶80.0 kg·hm-2，鼠茅草30.0 kg·hm-2。猕猴桃园行间翻耕耙平后播种，绿肥在猕猴桃园行间撒播。为避免草种与果树出现争水争肥，生草区与果树根部保持0.8 m的缓冲区。于出苗期进行杂草调查后，通过人工拔除杂草一次，此后至试验采样，未对试验地块进行施肥和除草，正常喷灌。

1.3.2样品采集及测定 2021年5月25日，于牧草盛花期按每小区“S”型5点钻取土芯5个（2.5 cm×20.0 cm），充分混合作为1个土样，去除植物根系与其他杂质后均匀混合，经2 mm土筛后分为2份，1份样品风干，用于测定土壤的理化性质；第2份样品保存于-80℃冰箱，及时送样测序。

1.4 测定指标和方法

1.4.1地上植物特征调查 杂草调查：于苗期杂草最旺盛的时期取1 m2样方调查杂草种类及数量。

越冬率：于越冬前（2020年12月1日）、返青后（2021年3月1日），在田间小区内划分固定的小区数计，越冬率（%）=越冬后苗数/调查总苗数×100%。

地上部生物量：于盛花期按照小区取1 m2样点，割取地上部称鲜重（g）。

1.4.2土壤理化性质测定 用内径40 mm土钻分别取5、10、15、20 cm处的土壤，采用烘干法测定土壤含水量（%）。采用电极电位法测定土壤pH值（1.0:2.5土水比浸提液）。采用重铬酸钾-浓硫酸外加热法测定有机质［28］。采用氯仿熏蒸直接浸提法测定微生物碳［29］，采用流动分析仪法测定微生物氮［30］。

1.4.3土壤酶活性测定 用苯酚钠比色法测定脲酶（urease）活性，用磷酸苯二钠比色法测定碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）活性，用3，5-二硝基水杨酸比色法测定蔗糖酶（sucrase）活性，采用高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶（catalase）活性［31］。

1.4.4土壤细菌多样性测序 采用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit试剂盒提取细菌总DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，同时采用紫外分光光度计（NanoDrop，Wilmington，DE，美国）对DNA进行定量。对16S rDNA（V3+V4）可变区进行PCR扩增，使用的引物为341F（5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3'）和805R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）［32］。PCR产 物 由AMPure XT beads（Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，美国）纯化，Qubit（Invitrogen，美国）定量。扩增子池用于测序，扩增子文库的大小和数量分别在Agilent 2100生物分析仪（Agilent，美国）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美国）的文库定量试剂盒上进行评估。在NovaSeq 6000平台上对库进行排序。

1.5 数据分析

用Microsoft Excel 2016进行数据初步整理，用SPSS 26软件进行单因素方差分析和显著性检验，显著性水平为α=0.05，用GraphPad Prism 8作图。Alpha多样性和Beta多样性均使用QIIME2计算，使用R（v3.5.2）作图，物种注释采用QIIME2的插件feature-classifier进行序列比对，比对数据库为SILVA和NT-16S数据库，以SILVA数据库注释结果为准。通过线性判别分析效应大小方法（linear discriminant analysis effect size，LEfSe）分析不同生草处理之间具有显著差异的物种，使用R语言vegan包进行非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling，NMDS）、细菌优势门和土壤环境因子冗余分析（redundancy analysis，RDA），采用R语言pheatmap包进行热图分析。

2 结果与分析

2.1 地上植物特征调查

2.1.1不同生草草种的越冬率比较 由图1可知，5个供试草种中鼠茅草越冬率最高，为93.45%，其次为白三叶、多年生黑麦草、毛苕子、草木樨，分别为84.65%、79.41%、59.37%、56.53%。

2.1.2不同生草处理杂草发生情况和地上部生物量比较 由表1可知，4个人工生草处理对猕猴桃果园杂草数量均有显著抑制效果（P＜0.05），其中Mode 2杂草株数最多，其次为Mode 3、Mode 1和Mode 4。人工生草处理地上部鲜草产量差异显著（P＜0.05），Mode 1地上部 鲜 草 产 量 最 大，为1107.41 g·m-2，较Mode 4（885.18 g·m-2）高25.11%，较Mode 2（705.57 g·m-2）高56.95%，较Mode 3（690.74 g·m-2）高60.33%。

表1 不同生草处理杂草发生情况和地上部鲜草产量Table 1 Weed occurrence and aboveground fresh yield of different cover crops treatments

2.2 不同生草处理对土壤环境因子的影响

2.2.1不同生草处理对土壤含水量的影响 由表2可知，在0～20 cm土层，4个人工生草处理下土壤含水量较CK均增加，但未表现出显著性差异。在0～5 cm、10～15 cm土层，Mode 1土壤含水量均最高，较CK分别增加22.44%、6.60%；在5～10 cm、15～20 cm土层，Mode 4土壤含水量均最高，较CK分别增加

表2 不同生草处理对0～20 cm土层土壤含水量的影响Table 2 Effect of different cover crops treatments on soil water content at a depth of 0-20 cm（%）

9.55%、43.98%。

2.2.2不同生草处理对土壤养分与酶活性的影响由表3可知，Mode 4较其他处理降低了猕猴桃果园的土壤pH，但未表现出显著性差异；4个人工生草处理下有机质含量较CK均增加，除Mode 2未达到显著水平，其他处理均达显著水平（P＜0.05），其中增幅最大的是Mode 1，有机质含量较CK增加38.63%，其次为Mode 4、Mode 3，分别增加23.24%、11.23%。另外，Mode 1较其他处理提高土壤微生物碳、氮含量的效果最明显，与CK相比，土壤微生物碳、氮含量分别提高了25.73%、36.25%，而Mode 3、Mode 4土壤微生物碳含量有降低趋势，与CK相比，分别降低了6.09%、5.63%。4个人工生草处理较CK均能提高果园土壤脲酶、碱性磷酸酶、蔗糖酶和过氧化氢酶活性，其中，Mode 1提高土壤脲酶、蔗糖酶活性最为显著（P＜0.05），分别为39.83%、60.79%；Mode 1、Mode 4提高土壤碱性磷酸酶活性的效果显著（P＜0.05），较CK分别提高了20.56%、14.63%。Mode 2、Mode 3较CK土壤碱性磷酸酶活性提高，但未达到显著水平；Mode 2、Mode 4提高土壤过氧化氢酶活性的效果显著（P＜0.05），较CK分别提高了16.70%、16.10%。

表3 不同生草处理对土壤养分与酶活性的影响Table 3 Effects of different cover crops treatments on soil chemical and biological characteristics

2.3 不同生草处理对土壤细菌多样性指数的影响

基于物种丰富度分析Alpha多样性，其Chao1指数和特征序列数主要是估计群落中包含物种的数目；Goods_coverage是指微生物覆盖率，其数值越高，则样本中新物种没有被测出的概率越低；Shannon指数来源于信息熵，Shannon指数越大，表示不确定性大，不确定性越大，表示这个群落中未知的因素越多，也就是多样性高。5个生草处理下土壤细菌Alpha多样性指数无显著差异，5组中的Goods_coverage均在99%左右，说明对土壤细菌微生物具有较高的覆盖度，可较为全面地揭示土壤样品的微生物组成。5个处理下Mode 3土壤细菌物种丰富度最高，Chao1和特征序列数分别为3040.59和2787.67，土壤细菌Shannon指数为Mode 1＞Mode 2=Mode 3＞CK=Mode 4（表4）。

表4 不同生草处理对土壤细菌Alpha多样性的影响Table 4 Effect of different cover crops treatments on Alpha diversity of soil bacteria

2.4 不同生草处理对土壤细菌多样性的影响

5个处理下土壤细菌群Feature分布特征如图2所示，5个处理共有的Feature数目为1338个，CK、Mode 1、Mode 2、Mode 3、Mode 4特有的Feature数目分别为2774、3624、3110、3648和3202。对5个处理的土壤细菌群落进行NMDS分析，结果表明（图3），5个处理土壤细菌群落分布较为集中，且各处理间未明显分开，表明5个处理土壤细菌群落结构无明显差异。

根据所有样本16S rDNA在门水平上的丰度信息（图4），5个处理土壤共有优势细菌群落从高到低分别为：变形菌门（Proteobacteria，25.40%～32.19%）、酸杆菌门（Acidobacteria，19.69%～25.90%）、浮霉菌门（Planctomycetes，8.76%～17.03%）、放 线 菌 门（Actinobacteria，7.68%～11.12%）、芽 单 胞 菌 门（Gemmatimonadetes，5.00%～6.95%）、绿弯菌门（Chloroflexi，4.50%～6.15%）、疣微菌门（Verrucomicrobia，2.20%～5.09%）、罗库菌门（Rokubacteria，2.78%～3.82%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，1.86%～4.26%）、匿杆菌门（Latescibacteria，1.81%～2.45%）。可以看出，Mode 1变形菌门相对丰度最高（32.19%），Mode 4酸杆菌门相对丰度最高（25.90%），Mode 2浮霉菌门、放线菌门、芽单胞菌门和绿弯菌门相对丰度较高（17.03%、11.12%、6.95%和6.15%），Mode 3疣微菌门、罗库菌门、拟杆菌门和匿杆菌门相对丰度较高（5.09%、3.82%、4.26%和2.45%）。

2.5 不同生草处理土壤细菌群落结构的LEfSe差异分析

采用线性判别分析效应大小方法（LEfSe）对不同类群中的主要细菌进行了定量分析，进一步阐明了土壤样品中鉴定出的细菌分支之间可能存在的相互作用。由图5可知，5个不同生草处理使猕猴桃园土壤细菌群落产生明显差异，共有10个细菌分支表现出显著差异，其中Mode 1存在6个差异显著的细菌分支，Mode 2存在3个差异显著的细菌分支，Mode 4存在1个差异显著的细菌分支。

2.6 细菌群落与土壤环境因子的响应关系

为进一步探究人工生草和自然生草的猕猴桃园土壤微生物群落变化的影响机制，以及确定能够引起这种变化所要改变的首要土壤环境因子，揭示生草-土壤-微生物间的相互作用关系，以土壤养分和酶活性为解释变量，微生物群落为响应变量，在门水平上对土壤细菌群落结构与环境因子进行冗余分析（redundancy analysis，RDA）。图6a显示了门水平相对丰度前十的物种与土壤环境因子之间的关系，RDA 1和RDA 2分别解释了总变化量的18.73%和11.17%，其中，pH、Cat对细菌群落结构影响较大。相关系数热力图（correlation coefficient heat map）能够直观地展现出不同土壤环境因子与细菌群落的相关性。由图6b可知，细菌群落结构门分类水平中芽单胞菌门与碱性磷酸酶（Alp）呈显著负相关关系（P＜0.05），绿弯菌门与pH显著正相关（P＜0.05），罗库菌门与微生物碳（MBC）呈显著负相关关系（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 不同生草处理田间表现差异

本研究中，人工生草可有效控制果园杂草数量，以鼠茅草效果最佳。对草种越冬率、4个人工生草处理的地上部生物量进行比较，结果表明：鼠茅草适应性强、耐寒，其越冬成活率高于其他几个草种，达93.45%。人工生草的4个处理中多年生黑麦草+毛苕子地上部鲜草产量最高，达1107.41 g·m-2，可向土壤提供更多的凋落物，为土壤微生物分解提供丰富的食物源［33］。

3.2 不同生草处理对土壤环境因子的影响

在一定的土壤含水量范围内，土壤呼吸速率随土壤水分的增加而增加［34-35］。本研究中，4个人工生草处理均可提高土壤含水量，这可能是由于绿肥生长迅速、茎叶茂盛、对地表遮蔽度高，可以明显地抑制根际表土水分的蒸发［36］。土壤有机质累积程度是土壤肥力的重要特征，是影响土壤物理性状、供肥保肥和养分有效性的关键因子。杨叶华等［37］指出，生草有利于活化土壤中的元素，提高土壤中有机质含量。本研究也发现，4个人工生草处理土壤有机质含量均高于自然生草，以多年生黑麦草+毛苕子效果最佳。其原因可能是猕猴桃园杂草生长不佳，生物量累计较少，致使土壤有机质含量少于人工生草土壤［38］。

酶作为土壤的组成部分，其活性的大小可较敏感地反映土壤中生化反应的方向和强度［31，39］。绿肥根系的胞外分泌物不仅直接增加了土壤有关酶种类，且根系分泌物和植被有机残体还提供了多种容易为微生物利用的营养和能源物质，从而增加了土壤微生物和相关酶类的活性［40］。与自然生草相比，多年生黑麦草+毛苕子、多年生黑麦草+草木樨、多年生黑麦草+白三叶和鼠茅草处理均能提高果园土壤脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性，其中，多年生黑麦草+毛苕子提高土壤脲酶、蔗糖酶及碱性磷酸酶活性效果最为显著。这与陈学森等［41］报道的苹果园种植毛苕子可显著提高土壤综合肥力的结果一致。这可能是由于多年生黑麦草+毛苕子地上部鲜草产量最高，为果园土壤输入了更多的杂草凋落物和根系分泌物，改变了土壤理化性质，从而引起土壤酶活性的变化［27］。

3.3 不同生草处理对土壤细菌群落结构的影响

细菌作为土壤微生物的主要类群，约占其总体数量的70%～90%，对土壤生态功能的作用至关重要，是土壤质量优劣的敏感指标。本研究利用高通量测序技术，对供试猕猴桃园不同生草模式的土壤细菌群落进行分析。结果表明，变形菌门、酸杆菌门和浮霉菌门为优势类群。变形菌门细菌是陆地生态系统的主要优势类群，生态幅度广，环境适应能力较强［42］。因此，猕猴桃园土壤管理方式的改变对其优势种群地位的影响较小。鼠茅草处理土壤酸杆菌门相对丰度较自然生草处理提高，这是由于酸杆菌门是嗜酸菌［43］，植被类型会影响其分布［44］，鼠茅草覆盖后牧草根系分泌物导致土壤pH下降，有利于酸杆菌生存，这与董慧［45］的研究结果一致。陈海生等［46］研究表明，绿弯菌门具有促进土壤有毒物质降解的作用，本研究发现多年生黑麦草+毛苕子和多年生黑麦草+草木樨处理下绿弯菌门相对丰度比自然生草分别提高了0.84和29.47个百分点，表明多年生黑麦草+毛苕子和多年生黑麦草+草木樨处理有利于降低土壤中的有毒物质，改善土壤生态环境。

本研究发现，3个豆禾混播组合（多年生黑麦草+毛苕子、多年生黑麦草+草木樨、多年生黑麦草+白三叶），与自然生草相比，土壤细菌类群的丰富度和多样性均有所增加，鼠茅草处理土壤细菌多样性等同于自然生草。这可能是因为生草种类的不同，输入底物的碳氮比有所不同。由于细菌群落之间存在功能补偿性，较高的细菌多样性可能支持更多的生态系统功能，产生有利于猕猴桃生产的各种物质，从而促进果园增产增收。本研究NMDS分析也表明，猕猴桃园5种生草处理土壤管理模式细菌群落组分未发生统计学意义上的显著变化，说明猕猴桃园土壤细菌群落较为稳定，短时间内的生草措施影响作用有限。

4 结论

与自然生草相比，4种人工生草均增加了土壤有机质含量，提高了果园土壤脲酶、蔗糖酶、碱性磷酸酶和过氧化氢酶活性，土壤理化性质的改变进而影响了土壤细菌群落结构特征。4种人工生草中多年生黑麦草+毛苕子、多年生黑麦草+草木樨、多年生黑麦草+白三叶提高了土壤细菌群落的丰富度和多样性，其中多年生黑麦草+毛苕子处理多样性最高，存在最多差异显著的细菌分支。相关分析表明，土壤pH和过氧化氢酶活性对细菌群落结构影响较大。本研究通过实践证明，人工生草对于改善猕猴桃园土壤质量，提高土壤有机质，增加土壤微生物群落多样性和丰富度均有重要作用，其中多年生黑麦草与毛苕子混播改良效果尤佳。