肝细胞癌组织Foxj2、PCDH20的表达与临床病理特征和预后的关系

马慧发,王劭炜,杨士民

(1.天津市天津医院 普通外科,天津300200;2.天津市南开医院 胃肠外科,天津300100)

肝癌在2018年全球恶性肿瘤流行病学调查中居发病率第7位、死亡率第3位[1]。我国肝癌的发病率和死亡率分别为26.92/10万和23.72/10万，居恶性肿瘤发病率第4位、死亡率第2位，其中肝细胞癌(HCC)在原发性肝癌中占比85%-90%，严重威胁人民生命健康[2]。近年来，有学者通过动物实验发现小鼠肝癌细胞内叉头框蛋白J2(Foxj2)基因对Smad2、Smad4等基因表达有抑制作用，从而对肝癌细胞增殖进行抑制[3]。另有研究提示原钙黏蛋白-20(PCDH20)是非成簇原钙黏蛋白的重要组成部分，其调节功能广泛，在神经系统信号传导、细胞增殖与凋亡中均有调节作用，且与鼻咽癌、肺癌等恶性肿瘤有关[4]。本研究拟分析Foxj2、PCDH20在HCC组织中的表达情况，探讨二者与预后的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入天津市天津医院2013年5月-2016年5月收治的HCC患者83例。纳入标准：经手术(肝癌根治性切除术)切除标本病理检查证实为HCC者，年龄>18岁；首次确诊的患者；未见远处转移者；术前血常规、AFP、腹部超声、CT或MRI等检查完善者；具备手术指征，均完成手术者；自愿签署知情同意书者。排除标准：患免疫系统、血液系统疾病者；入院前近6个月内有大手术史者；患其他部位的原发性肿瘤者；患严重心脑血管疾病者(例如心肌梗死、脑梗死等)；有精神障碍史者。

其中男48例，女35例，年龄34-70岁，平均(55.29±12.24)岁；TNM分期：T1期18例，T2期35例，T3a期30例；乙肝表面抗原(HBsAg)阳性48例，阴性35例；Child-Pugh分级：A级55例，B级28例。研究方案获医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1检测方法 采用免疫组化法测定HCC组织、癌旁组织(距离肿瘤3-5 cm)中Foxj2、PCDH20表达情况。DAB显色试剂、中性树胶、Foxj2多克隆抗体、PCDH20多克隆抗体，均购于上海科敏生物科技有限公司。

1.2.2检测结果评估 免疫组化结果分析[5]：由2名高资质的病理科医生采用双盲法阅片，在高倍视野(×200)下观察切片染色情况，以出现棕黄、棕褐色显色提示为阳性细胞。染色强度计分：无着色、浅黄、棕黄、棕褐色分别计0、1、2、3分。阳性细胞占比计分：<1%、1%-25%、25%-50%、50%-75%、≥75%分别计0、1、2、3、4分。二者乘积为最终染色计分结果，0-2分为阴性，≥3分为阳性。

1.2.3血常规、AFP及HBsAg检查 在患者入院当日，采集4 ml肘静脉血分装为两管，其中一管离心10 min(转速3 000 r/min,半径11 cm)，分离血清，存至-80℃下备用；另一管不做离心处理，加入抗凝剂，以相同条件保存备用。采用化学发光免疫分析法检测血清AFP水平，试剂盒购自深圳市新产业生物医学工程股份有限公司；采用BC-6800Plus全自动血液细胞分析仪(深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司)测定血小板计数(PLT)、中性粒细胞与淋巴细胞比值(NLR)；通过化学发光免疫分析法测定HBsAg，试剂购自日本希森美康株式会社。

1.3 随访跟踪

随访时间为5年，以患者术后第1 d为起始日，随访截止时间为2021年5月，随访方式根据患者的实际情况选择，包括门诊随访、电话随访、微信随访。记录患者术后5年累积生存时间，累积生存时间即术后第1 d至死亡的时间。

1.4 统计学方法

经SPSS20.0软件行数据分析。以百分比(%)表示计数资料，行χ2检验。采用Kaplan-Meier法及Log-rank检验分析不同Foxj2、PCDH20表达患者的无瘤生存率与累积生存率。利用Spearman相关性分析Foxj2、PCDH20表达的相关性。经COX风险回归模型分析HCC患者的预后影响因素。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC组织、癌旁组织中Foxj2、PCDH20表达比较

HCC组织中Foxj2、PCDH20阳性表达率低于癌旁组织(P<0.05)，见表1。

表1 HCC组织癌旁组织中Foxj2、PCDH20表达比较[n(%)]

2.2 HCC患者Foxj2表达与临床病理特征的关系

根据Foxj2表达情况将患者分为Foxj2阴性组、Foxj2阳性组。Foxj2阴性组临床分期T3a期、门静脉癌栓、多发肿瘤(经肝癌根治性切除术后检查证实)、HBsAg阳性、低分化、肿瘤直径≥5 cm人数占比高于阳性组(P<0.05)，两组性别、年龄、术前PLT、术前NLR、术前AFP、Child-Pugh分级比较无差异(P>0.05)，见表2。

表2 HCC患者Foxj2表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.3 HCC患者PCDH20表达与临床病理特征的关系

PCDH20阴性组临床分期T3a期、门静脉癌栓、多发肿瘤、HBsAg阳性、低分化、肿瘤直径≥5 cm人数占比高于阳性组(P<0.05)，两组性别、年龄、术前PLT、术前NLR、术前AFP、Child-Pugh分级比较无差异(P>0.05)，见表3。

表3 HCC患者PCDH20表达与临床病理特征的关系[n(%)]

2.4 不同Foxj2、PCDH20表达患者的预后比较

随访5年，在83例患者中，有8例失访。Foxj2阴性组的累积生存率为21.15%(11/52)，Foxj2阳性组的累积生存率为52.17%(12/23)；Foxj2阴性组累积生存率低于阳性组(Log-rankχ2=4.869，P=0.027)。PCDH20阴性组累积生存率为21.82%(12/55)，PCDH20阳性组累积生存率为55.00%(11/20)；PCDH20阴性组累积生存率低于阳性组(Log-rankχ2=4.486，P=0.034)。具体生存曲线图见图1-2。Spearman相关分析提示HCC患者Foxj2与PCDH20表达呈正相关(rs=0.624，P<0.001)。

图1 不同Foxj2表达患者的累积生存曲线图

2.5 HCC患者预后的COX风险回归模型分析

将相关变量纳入COX风险回归模型，以HCC患者预后为因变量X(生存=0，死亡=1)，结果提示临床分期T3a期、门静脉癌栓、低分化是预后的危险因素，而Foxj2、PCDH20阳性表达是预后的保护因素(P<0.05)，见表4。

表4 HCC患者预后的COX风险回归模型分析

3 讨论

HCC是较常见的一种恶性肿瘤，目前，手术切除仍是治疗HCC的主要方式，随着临床诊疗技术的进步，外科手术方案较过去已取得了较大进展，但总体生存率仍不理想，据既往研究报道HCC术后1年、3年、5年的生存率分别为85.5%、66.7%、20.7%[6-7]。

图2 不同PCDH20表达患者的累积生存曲线图

近年来，研究指出肝癌致病原因复杂，涉及到环境、遗传、慢性肝炎、细菌感染等多种因素，上述因素可能通过影响肝细胞中的信号转导，导致相关基因、蛋白表达出现异常改变，参与肿瘤进展[8-9]。动物实验发现Foxj2能对肝癌小鼠的HepG2细胞体外增殖进行抑制，并可抑制肿瘤生长[10]。另有研究认为PCDH20对Wnt/β-catenin信号通路有调控作用，可发挥抑癌功能[11]。

Foxj2是叉头框蛋白家族的一员，在非小细胞肺癌组织中Foxj2阳性表达低于癌旁组织，它可通过调节钙黏蛋白基因转录影响细胞浸润、迁移[12]。另有研究指出Foxj2在非小细胞肺癌组织中表达下调，其过表达能对转化生长因子-β1诱导的上皮-间充质转化进行抑制，而将其敲除，则可促进上皮-间充质转化，导致肿瘤进展，这表明Foxj2可能通过调节上皮-间充质转化发挥作用，这可能是Foxj2在肿瘤中的一种作用机制[13]。PCDH20是非成簇原钙黏蛋白的重要组成部分，生物功能非常广泛，在神经系统信号传导中有调节作用，具有抑癌功能，其异常表达对肝癌患者耐药性有较大影响，PCDH20表达降低，可导致肝癌患者对5-氟尿嘧啶的耐药性增强，其过表达则能使肝癌耐药性降低，这提示PCDH20在肝癌中发挥抑癌作用[14]。Foxj2、PCDH20在HCC中均具有抑癌作用，二者在HCC组织中表达下调可能与患者自身的癌细胞增殖过快，机体抗癌作用下降有关。

HCC患者的临床病理特征复杂，其病理表现的复杂性可能与相关癌基因、蛋白的表达相关[15]。本研究结果发现HCC患者Foxj2、PCDH20表达与临床分期、门静脉癌栓、肿瘤数目、分化程度及肿瘤直径有关。Foxj2、PCDH20在肝癌中发挥抑癌作用，二者阴性表达提示抑癌作用削弱，导致HCC患者病情进一步进展，临床分期增高，分化程度降低，肿瘤体积增大，增加了门静脉癌栓以及多发性肿瘤发生风险。本研究显示Foxj2、PCDH20阴性表达HCC患者5年累积生存率较阳性患者降低，二者呈正相关且阳性表达是患者预后的保护因素。Foxj2可能通过对E-钙黏蛋白基因转录进行调控，从而调节癌细胞浸润与转移[16]，而PCDH20在HCC中可能通过调控Wnt/β-catenin信号通路产生抑癌作用[17]。Foxj2、PCDH20在肝癌中均具有重要调控作用，二者的阴性表达能促进肝癌进展，可能通过调控与肝癌相关的信号通路或因子，共同影响肝癌患者病情。

综上所述，HCC组织中Foxj2、PCDH20的阴性表达率较高，二者阴性表达会降低患者5年累积生存率，导致预后不良。