基于COI基因序列的日本医蛭疑似种鉴定

2022-10-23余米苏胜齐周梦曹敏封孝兰

西南大学学报（自然科学版） 2022年10期

余米，苏胜齐，周梦，曹敏，3，封孝兰

1. 重庆市药物种植研究所，重庆南川 408435； 2. 西南大学水产学院，重庆 400715；3. 特色生物资源研究与利用川渝共建重点实验室，重庆南川 408435

日本医蛭(Hirudonipponia)俗称水蛭、日本医水蛭或稻田医蛭等，隶属于医蛭形亚目(Hirudiniformes Caballero)、医蛭科(Hirudinidae Whitman)、医蛭属(Hirudo)，在我国众多省份均有野生资源分布[1]，其人工养殖地主要集中在山东、重庆、广东以及东北各省市[1-2]．日本医蛭是《中华人民共和国药典》收录的唯一的吸血蛭，在我国最早被应用在断指再植、皮肤撕脱伤和解除皮瓣瘀血的研究中[3-4]；又因其咽周体含有高效抗凝血物质(水蛭素和肝素)，被作为心脑血管疾病药物的主要动物原材料．虽然近年来日本医蛭人工养殖与繁育取得了一定的突破[2， 5]，但人工养殖产量依然不能满足市场的需求，其药材伪混现象严重，常以外形和习性相似的其他蛭类冒充日本医蛭，替代品以菲牛蛭为主[6-7]．因此对基于COI的日本医蛭疑似种进行鉴定，有利于以日本医蛭为原料的中成药的基原保证．

《中国动物志·环节动物门·蛭纲》记录：不同蛭类的种间鉴定主要通过背部纵纹的颜色、数量和形状，雌雄生殖孔所在位置以及阴道囊的形状等来区分[1]．但其外部形态和体色易受环境影响，因此传统鉴定方法具有不确定性，而分子鉴定具有快速、准确等特点，在蛭类的鉴定中已有报道，且多用于蛭类种间遗传距离和遗传多样性分析[8-10]．COI是动物线粒体氧化呼吸链中的重要基因，在蛭类种群遗传结构和分子系统发育等研究方面应用广泛．已有学者应用COI序列分析了日本医蛭、宽体金线蛭、尖细金线蛭、光润金线蛭、日本山蛭、菲牛蛭、棒纹牛蛭、八目石蛭等物种的亲缘关系[11-12]． Borda等[13-14]采用COI序列研究《中国动物志·环节动物门·蛭纲》中多个物种，发现传统分类与系统分类进化结果存在一定的差异．目前，蛭类COI序列的研究主要集中在对已知蛭类品种亲缘关系的分析上，关于日本医蛭疑似种的鉴定尚无研究报道．现以市场上流通的日本医蛭疑似种为研究对象，测定COI序列，比较其序列特征并检验其利用COI序列鉴别日本医蛭与其疑似种的可行性．

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验组样品购买于山东省鱼台县王庙镇水蛭市场，根据其背部形态分为10类，每一类至少5个样本完全一致，依次编号为YS1～YS10(图1)，对照组日本医蛭(CK， 5个样本)为重庆市药物种植研究所养殖，共计11类．根据背部形态选取每类1尾水蛭进行解剖取肌肉组织，将组织样品附着的血液冲洗干净，置于-80 ℃冰箱中保存备用，其余样品备用．

图1 日本医蛭及疑似种背部图

1.2 样本DNA提取、 PCR扩增及测序

1.2.1 DNA提取和目的基因扩增

采用天根海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，并对线粒体COI基因片段进行PCR扩增．使用的上游引物LCO1490(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)和下游引物HCO2198(5′-TAAACTTCAGGGTGACCCAAAAAATCA-3′)由北京天一辉远生物科技有限公司合成[15]． PCR 扩增的反应体系为40 μL，包括 20 μL 2x EasyTaq PCR SuperMix，上、下游引物各1.5 μL， DNA模板1 μL， 16 μL ddH2O．反应条件： 95 ℃预变性1 min； 95 ℃变性1 min， 45 ℃退火1.5 min， 72 ℃延伸1.5 min， 5个循环； 95 ℃变性1 min， 50 ℃退火1.5 min， 72 ℃延伸1 min， 35个循环； 72 ℃总延伸5 min． PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2．

图2 11种蛭类COI-PCR扩增图

1.2.2 测序结果

测序结果采用DNAstar 7软件中的SeqMan进行序列拼接，拼接获得单个个体完整的序列后，利用MAGE 5.0软件的Align功能进行多序列比对，将比对结果保存为.meg文件构建NJ(邻位相连法： neighbor_joining)和ML(最大似然法： maximum likelihood)进化树．对照组COI基因序列登录号为GQ368749.1．

1.3 不同种蛭类的抗凝血酶活性测试

根据COI基因的鉴定结果，抗凝血酶活性试验分为CK组、 YS7组以及其他组(YS1～YS10，除YS7)，每组样本总质量2 g以上， 3次重复，参照《中华人民共和国药典》中水蛭抗凝血酶活性的方法进行测试[16]．

2 结果与分析

2.1 11种蛭类COI序列分析

11种蛭类的COI基因碱基组成如表1， CK的COI序列长度为680 bp，碱基A，T，C，G质量分数分别为35.1%，28.7%，16.2%和20.0%，碱基AT质量分数为63.8%， YS1～YS10的碱基A，T，C，G质量分数分别为39.8%，29.4%，15.2%和14.9%，碱基AT质量分数为69.2%．在所测的种类中CK的AT质量分数最低，序列最短， YS5和YS9序列长度为681 bp，其余种序列长度均为684 bp．在所测的11种蛭类COI序列中有569个一致位点， 84个变异位点，其中40个位点发生了碱基转换， 44个位点发生了碱基颠换，转换主要发生在AG之间，颠换主要发生在AT之间，转换与颠换的比值为0.90(表2)．

表1 11类蛭类COI基因的碱基组成

表2 COI序列碱基替换

2.2 遗传距离与系统发育

11种蛭类的平均遗传距离(表3)为0.038，日本医蛭与被测试的10种蛭类的遗传距离均大于0.159． YS4，YS5，YS6，YS8与YS3的遗传距离均为0.001， YS1与YS2的遗传距离为0.003， YS9与YS10的遗传距离为0.000．结合NJ和ML系统发育树(图3，图4)YS3，YS4，YS5，YS6，YS8聚为一大类， YS1，YS2，YS9，YS10聚为一类，对照组日本医蛭均不与疑似种聚为一类．除YS7外， YS1～YS10的平均种间遗传距离为0.007，小于0.020，说明这9个物种属于同一物种． CK与YS1～YS10(不包括YS7)之间的平均种间遗传距离为0.162， YS7与YS1～YS10之间的平均遗传距离为0.025，是YS1～YS10平均种内遗传距离的3.749 倍．

表3 11种蛭类的COI基因的遗传距离

图3 基于COI基因序列构建的NJ系统进化树

图4 基于COI基因序列构建的ML系统进化树

2.3 不同种蛭类的抗凝血酶活性

分别对养殖的日本医蛭类、鉴定的YS7类以及其他类吸血蛭进行抗凝血活性测定，结果显示， YS7类和其他类吸血蛭均有较强的抗凝血酶活性(图5)．

图5 3种蛭类的抗凝血酶活性

3 讨论

水蛭的鉴定主要有基于其形态特征和DNA分子鉴定两种方式，形态特征鉴定主要根据其外部形态和生殖器官的形状来区分[17-19]，而DNA分子鉴定主要是PCR技术和DNA条形码技术[20]．目前基于COI序列的 DNA 条形码技术已被广泛应用于药用水蛭的分类以及水蛭相关中成药的基原鉴定中[21]．相较于传统的形态特征鉴定方法，基于COI序列的 DNA 条形码技术具有快速准确等优点，能有效避免因为形态的相似性造成的误认．

本试验中被测序的11种水蛭，其COI序列长度为680～684 bp，碱基AT质量分数在63.8%～69.7%之间，与徐云玲等[11]的研究结果类似．本试验所测样品碱基均存在明显的偏好性，且YS1～YS10的AT质量分数明显高于CK(日本医蛭)的AT质量分数．李咏梅等[22]认为在动物线粒体DNA的变异中，近亲种间更容易频繁发生转换，而颠换则更容易发生在远缘种间．本试验结果转换与颠换的比值为0.90，说明本试验所鉴定的水蛭品种与日本医蛭亲缘关系较远．根据软件MEGA 5.0计算11种蛭类种间遗传距离，在ML和NJ系统进化树中CK与YS7遗传距离最近，所测其他疑似种则聚为一大类，其平均种间遗传距离为0.007<0.020， Hebert等[23]认为鉴定最小种间遗传距离为0.020，说明这9个样品属于同一物种． CK与YS1～YS10(不包括YS7)之间的平均种间遗传距离为0.162． YS7与YS1～YS10之间的平均遗传距离为0.025，是YS1～YS10平均种内遗传距离的3.749倍，并没有达到10倍以上．综上所述，被测的11种水蛭中， CK与疑似种的亲缘关系较远， YS7为一物种，另外9种蛭类为同一物种．

测试的疑似种均来源于山东鱼台县，其外部形态与丽医蛭(只分布在浙江省)差异较大，可以断定所测试的疑似种并不是丽医蛭，且根据本文的结果可以判定为2个新种．《中国动物志·环节动物门·蛭纲》中记载了我国蛭类共有93种，其中吸血蛭有日本医蛭、丽医蛭、菲牛蛭、南京牛蛭、湖北牛蛭、棒纹牛蛭、天目山蛭等．而杨谋等[7]认为日本医蛭是传统中医使用品种和医学古典中记录的品种，加之日本医蛭的抗凝血活性远远高于非吸血蛭[24-26]，因此具有较高的生态和经济价值．但由于我国耕作方式的改变使连续性水体成为了季节性水体，严重影响了日本医蛭的生存环境[7]，加之历史上为发展农业对稻田水域日本医蛭的大量捕杀[27]，以及现有养殖模式相对落后等因素，导致其资源量远不能满足市场需求．而在山东鱼台境内YS1～YS10的野生资源相对丰富，且抗凝血酶活性较强，表明了这2种水蛭具有较高的潜在利用价值，可作为日本医蛭的补充替代品种进行深入研究．