覆膜金属罐中PBT/PET环状低聚物在食品中的迁移测试及基于膳食暴露量的风险评估

李倩云1, 吴刚2, 王亚2, 王晓龙2, 潘峰1, 张泓1, 邢航1, 李建文1*, 朱蕾1*

（1. 国家食品安全风险评估中心, 北京 100022；2. 中国食品发酵工业研究院, 北京 100015）

金属覆膜是一种通过热熔、淋膜或粘合的方法将塑料薄膜附着在金属基板表面的技术[1］。常用的金属基板包括镀铬铁、马口铁、铝板以及冷轧薄钢板等, 其中镀铬铁具有优异的耐腐蚀性能和涂覆性能, 且成本低、外观独特[2］, 成为覆膜铁的主要材料, 是食品罐、啤酒罐以及饮料罐首选的金属基板[3］。金属罐覆膜材料包括聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、聚丙烯（PP）、聚乙烯（PE）、聚对苯二甲酸丁二醇酯（PBT）和聚对苯二甲酸己二酸丁二醇酯（PBAT）等, 其中PET的综合性能最优, 具有成型易、可杀菌、硬度高、耐磨以及经特殊处理可印刷等特性[4］。与传统的马口铁、涂料铁相比, 覆膜铁作为一种新型的复合材料, 具有优异的耐腐蚀性、耐加工性、防锈性、防潮性和阻隔性, 其生产工艺简洁高效、低碳、低耗能、无废液废气排放[5-6］, 具有绿色环保、可减少碳排放以及可回收等特点。随着国内外金属罐类食品接触材料需求的巨大增长, 以及全球资源可持续利用和绿色环保的发展理念, 覆膜金属罐的市场占有率将日益上升, 在罐装食品包装方面的应用也会越来越广泛。

然而, 用作食品金属罐覆膜的主要为PET、PBT和PBAT等几种物质的共聚产物, 这些热塑性树脂薄膜在聚合过程中由于温度、氧气等的作用, 会发生热降解、氧化等副反应, 或在酯交换/酯化过程中由于反应不完全或聚合物的水解等生成PET和PBT环状低聚物[7］等非有意添加物（NIAS）, 并通过接触迁移到食品中。目前国内外均无PET和PBT环状低聚物毒理学的研究报道, 此类物质也不在GB 9685-2016[8］的添加剂列表和GB 4806. 6-2016[9］的特定迁移限量物质列表中, 目前仅通过食品接触材料及制品通用安全要求[10］进行通用管理。因此, 对于覆膜金属罐迁移到食品中的PET和PBT环状低聚物的量及安全性应引起关注, 并亟需建立简便有效的方法对我国居民通过与食品接触的覆膜金属罐中的PBT和PET环状低聚物的膳食暴露量进行风险评估。

毒理学关注阈值（TTC）作为一种有效的风险评估工具, 其基本原理是认为所有化学物质均可确定一个普适的安全暴露阈值, 当人体暴露水平低于相应的阈值时, 不会对人体健康产生危害。目前, 对于PET和PBT环状低聚物迁移量的检测已有研究, 如徐彤彤等[11］首次采用超高效液相色谱-质谱联用技术（UPLC-QTOF MS）对层压钢罐中的PET和PBT环状低聚物进行定性和定量分析, 研究了6种低聚物在3种食品模拟物中的迁移量；Emmanouil等[12］采用TTC方法对宠物茶包中的PET低聚物进行了风险评估。但国内外很少有对覆膜金属罐迁移到食品中的PET和PBT环状低聚物进行风险评估的报道, 因此有必要根据我国消费者食物消费量的特点, 结合市场上覆膜金属罐中PET和PBT环状低聚物的迁移情况进行风险评估以评价其安全性。

本文结合金属覆膜中可能迁移出的PET和PBT环状低聚物的特点, 建立了食品中这两种物质迁移量的检测方法。基于迁移试验结果、我国人群食物消费量调查、与食品接触面积和食品单位质量/体积比（S/V）调查结果, 运用TTC定量风险评估方法, 对我国市售食品覆膜金属罐包装中迁移出的PET环状二聚体、PET环状三聚体、PET环状四聚体、PET环状五聚体和PBT环状二聚体、PBT环状三聚体6种低聚物（图1）开展评估, 初步评估其健康风险。

图1 PET和PBT环状低聚物分子结构图Fig. 1 The chemical structures of cyclic PET and PBT oligomers

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与样品

Agilent 1290 UPLC-Agilent 6546 UHD QTOF MS（美国安捷伦仪器公司）；KQ-500DE超声波清洗仪（中国江苏昆山超声波仪器有限公司）；TG18K高速离心机（上海舜制仪器制造有限公司）；VORTEX05涡旋混匀器（上海达姆实业有限公司）；AB204-N分析天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；UGC-45C圆形水浴氮吹仪（北京优晟联合科技有限公司）；QSE-12D固相萃取仪（上海比朗仪器制造有限公司）。

PET环状低聚物标准品（北京汇科同创科学仪器有限公司）；PBT环状低聚物标准品（北京百灵威科技有限公司）；乙腈、甲醇、甲酸、甲酸铵（质谱纯, 上海霍尼韦尔贸易有限公司）；二氯甲烷、正己烷、无水乙醇（色谱纯, 德国Merck公司）；2, 2, 2-三氟乙醇（色谱纯, 西格玛奥德里奇贸易有限公司）；六氟异丙醇、N-丙基乙二胺固相吸附剂（PSA）、三氧化二铝（色谱纯, 上海安谱实验科技股份有限公司）；氯化钠、无水硫酸镁（色谱纯, 中国医药上海化学试剂公司）, 聚四氟乙烯（PTFE）滤膜（0. 22μm, 天津津腾实验设备有限公司）。

检测样品为市面购买的水果罐头、饮料、啤酒覆膜金属罐, 并根据样品的实际情况对最小（Min）、最大（Max）和平均（Mean）S/V结果进行统计。

1.2 标准溶液的配制

4种PET环状低聚物标准储备液（1 000 mg/L）：分别准确称取PET环状低聚物标准品1 mg（精确至0. 01 mg）至棕色小瓶中, 加入1 mL六氟异丙醇（HFIP）, 混匀。

PBT环状二/三低聚物标准储备液（1 000 mg/L）：准确称取PBT环状二/三低聚物标准品1 mg（精确至0. 01 mg）至棕色小瓶中, 加入1 mL HFIP, 混匀。

混合标准工作液（10 mg/L）：分别准确量取6种环状低聚物标准储备溶液（1 000 mg/L）0. 1 mL至10 mL容量瓶中, 以乙腈定容至刻度线, 混匀。系列混合标准工作液：分别精确量取0. 010、0. 025、0. 050、0. 100、0. 250、0. 500 mL混合标准工作液（10 mg/L）于5 mL容量瓶中, 用乙腈定容至刻度线, 得到质量浓度分别为20、50、100、200、500、1 000μg/L的混合标准工作液。

1.3 样品制备及实验方法

1.3.1 样品固相萃取处理将食品样品全部均质（约2 min）, 取2 g样品置于离心管中, 室温下稳定15 min后进行样品提取。向离心管中加入10 mL含0. 1%甲酸的乙腈溶液, 涡旋5 min。将处理后的样品放入冰箱（4℃）储存一夜。第二天将样品从冰箱中取出并于4 000 r/min离心10 min, 吸取上清液在常温下进行氮吹, 至溶液剩余约1 mL, 向溶液中加入5μL甲酸, 混匀。使用甲醇和含0. 1%甲酸的水对固相萃取柱（Agilent Bond Elut C18, 500 mg, 3 mL）进行预处理, 然后将上述混合溶液转移入柱, 最后使用1 mL乙腈洗脱分析物, 将所得溶液过PTFE滤膜, 使用UPLC-QTOF MS分析。

1.3.2 样品QuEChERS处理将食品样品全部均质, 称取2 g样品置于50 mL离心管中, 加入8 mL六氟异丙醇-2, 2, 2-三氟乙醇-乙醇混合溶剂（体积比2∶2∶4）、3. 0 g无水MgSO4和0. 8 g NaCl, 将混合物涡旋2. 0 min后于6 000 r/min离心10 min。吸取上清液2 mL至15 mL离心管中, 加入100 mg无水MgSO4、20 mg PSA和200 mg Al2O3, 将混合物涡旋2 min后于6 000 r/min离心10 min。取1 mL上清液过PTFE滤膜, 使用UPLC-QTOF MS分析。

1.3.3 样品液液萃取处理将样品内容物全部均质, 称取均质样品2. 0 g, 置于10 mL离心管中。加入8 mL乙腈, 将混合物涡旋振荡5 min, 随后超声20 min, 于4 000 r/min离心10 min。取上清液于常温下氮吹至干, 再用1 mL乙腈复溶, 过PTFE滤膜, 使用UPLC-QTOF MS分析。

1.3.4 仪器条件对于PET及PBT低聚物, 采用UPLC-QTOF MS和质谱检测器的信息相关采集（IDA）模式进行测试, 具体条件如下：流动相A为水（含0. 1%甲酸和2 mmol/L甲酸铵）；B为甲醇（含0. 1%甲酸和2 mol/L甲酸铵）, 流速为500μL/min；梯度洗脱程序为：0～0. 5 min, 20% B；0. 5～2 min, 20%～70%B；2～7 min, 70%B；7～17 min, 70%～100%B；17～17. 5 min, 100%B；17. 5～20 min, 100%～20%B；柱温为35℃；注射体积为5μL；扫描模式为正模式的增强子离子（EPI）扫描, 离子源温度为550℃, 喷射电压为5 500 V, 质量范围为m/z 80～1 500, 碰撞电压为10 V, 气帘气压力为241 kPa（35 psi）, 碰撞气压力为48 kPa（7 psi）；MS/MS收集质量范围为m/z 50～1 500, 碰撞能量设置为（35±15）V。

1.4 风险评估

1.4.1 TTC评估方法本研究采用的TTC评估方法主要参考欧洲国际生命科学学会（ILSI）改进的TTC评估方法以及欧洲食品安全局（EFSA）推荐的TTC评估通用流程[13］, 采用欧洲化学品局建立的Toxtree软件[14］进行归类, CramerⅠ、CramerⅡ、CramerⅢ三类物质的TTC安全阈值分别为30. 0、9. 0、1. 5μg/kg·BW/d。

1.4.2 膳食暴露评估方法目前国际上食品接触材料的暴露评估方法共分为3种：传统方法、双因子法和接触面积法。传统方法易偏离实际膳食暴露水平；双因子法的数据需要从行业企业调查中得到, 数据获得性较差, 且得到的数据不够准确、全面, 导致结果有很大的不确定性；接触面积法获得的是实际消费数据, 工作量相对较大, 但数据更加准确, 更能反映真实水平。因此本研究采用食品接触面积法进行膳食暴露评估。

采用食品接触面积法对食品接触材料暴露进行评估需要获得3个参数：（1）人群食物消费量数据（kg/kg·BW/d）；（2）物质迁移量（mg/dm2）；（3）与食品接触面积和食品单位质量/体积比（S/V）（dm2/kg）。估计膳食暴露量（EDI）公式如下：

EDI（mg/kg）=与食品接触面积（dm2）/食品质量或体积V（kg）×物质迁移量（mg/dm2）×食物消费量（kg/kg（食品））。

1.4.3 食物消费量调查方法借助我国食物消费量调查工作平台, 选取山东省德州市的12个社区, 共计60户181人作为调查对象, 采用回顾法、食物称重法、记账法和食物日记法等调查方法对被调查人群非连续2 d 24 h内摄入的全部预包装食品种类、重量、品牌、包装类型、包装材质、包装面积、规格、口味、消费量、消费频率、包装材质及其面积等信息进行收集整理。

1.4.4 与食品接触面积和食品单位质量/体积比（S/V）的调查方法本研究通过行业调查、市场采样和线上采购3种方式开展数据调查。调查内容包括食品类别、保质期、食品特性、规格、包装类型、食品接触材料材质和面积、样品照片等27个项目, 对食品特性、所用包装材质、食品质量、接触面积等数据进行测量后汇总分析, 计算获得S/V。材质采用目视法和红外光谱法结合的分级确认方法[15］。GB 31604. 1-2015《食品安全国家标准 食品接触材料及制品迁移试验通则》[16］规定, 结果换算中S/V的选择要反映实际的使用情形, 取可预见使用情形下的最大S/V, 当无法估算时, 一般采用6 dm2/L（液态食品密度以1 kg/L计）进行计算。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的选择

本实验分别考察了采用固相萃取、QuEChERS和液液萃取3种方法对实验样品进行提取分析的效果。结果发现, 使用固相萃取和QuEChERS两种方法处理后, 6种目标物的回收率均在80%以下, 可能是在样品处理过程中损失较大所致。而当使用液液萃取进行样品处理时, 目标物的回收率为80%～120%。因此, 本实验选择液液萃取对样品进行处理。

2.2 提取溶剂的优化

2.2.1 提取溶剂种类的优化分别考察了乙腈、甲醇和二氯甲烷3种提取溶剂对样品中6种目标物（空白样品中加入低聚物标准溶液）提取效率的影响。由图2可知, 甲醇为提取溶剂时, 6种目标物的回收率较低, 均在80%以下；二氯甲烷作为提取溶剂时, PET环状二聚体和PBT环状二聚体的回收率仍然低于80%。而乙腈作为提取溶剂时, 6种目标物的回收率均在80%～120%之间。因此, 采用乙腈作为PET和PBT环状低聚物的提取溶剂。

图2 3种提取溶剂对目标物回收率的影响Fig. 2 The effect of three extraction solvents on the recovery of the target compounds

2.2.2 提取溶剂体积的优化提取溶剂体积也是影响目标物提取效率的一个重要因素, 本实验对提取溶剂体积进行了优化。结果发现, 随着提取溶剂体积的增加, 6种目标物的回收率均逐渐升高, 当提取溶剂体积大于6 mL时, 目标物的回收率趋于平缓。为了保证提取结果的稳定性, 本实验选择8 mL作为提取溶剂的体积。

实验过程中发现涡旋后再对样品进行超声处理, 可以得到更好的提取效果。对于氮吹后使用的乙腈、甲醇和含0. 1%甲酸铵的乙腈溶液3种复溶溶剂进行考察, 结果表明, 当使用乙腈作为复溶溶剂时, 所得的溶解效果最好。因此, 本实验选择乙腈作为氮吹处理后的复溶溶剂。

2.3 线性范围与检出限

向3种食品中加入6种PET及PBT环状低聚物的系列标准溶液, 在优化条件下进行测试, 以6种低聚物的质量浓度（X, μg/L）和峰面积（Y）绘制标准曲线。结果表明, 6种低聚物的线性范围为10～1 000μg/L, 相关系数均大于0. 992, 表明本方法线性良好。

以未检出低聚物的食品样品为空白试样进行提取试验, 取不同浓度（低于限量0. 01μg/L）的溶液加标, 计算目标峰的信噪比（S/N）并进行验证, 依据S/N≥3确定检出限；S/N≥10确定定量下限。通过计算得到6种低聚物的检出限为0. 11～44. 12μg/L, 定量下限为0. 36～147. 06μg/L。

2.4 相对标准偏差及回收率

按照本方法对水果罐头、饮料和啤酒样品进行50、100、200μg/L 3个水平的加标回收实验, 平行测定6次, 计算回收率和相对标准偏差（RSD）, 结果见表1。水果罐头的平均加标回收率为80. 7%～103%, RSD为1. 3%～7. 2%；饮料样品的平均加标回收率为80. 6%～119%, RSD为0. 40%～5. 5%；啤酒样品的平均加标回收率为80. 8%～119%, RSD为0. 40%～9. 3%。结果表明方法的回收率和精密度良好, 满足检测要求, 可以准确测定覆膜铁罐装食品中PET及PBT环状低聚物的迁移量。

表1 水果罐头、饮料和啤酒3种食品类型中目标物的平均加标回收率和相对标准偏差Table 1 The average recoveries and relative standard deviations of target substances in fruits cans, beverages and beer

2.5 实际样品迁移测试

利用建立的方法对3类不同食品类别的覆膜金属罐中可能迁移的PET和PBT环状低聚物进行分析。由表2可知, 接触饮料食品的覆膜金属罐中PET和PBT环状低聚物的迁移量明显高于其他两类食品, 其中PET环状三聚体的平均迁移量高达35. 91μg/dm2, 其次为PBT环状二聚体, 平均值为17. 34μg/dm2；接触啤酒的覆膜金属罐中PET环状二聚体的迁移量整体偏低, 其平均值为0. 012～1. 61μg/dm2。通过对样品测试可知, 饮料的pH值＜水果罐头的pH值＜啤酒的pH值, 饮料的酸性最强。因此, 可能导致接触饮料食品的覆膜金属罐中PET和PBT环状低聚物在酸性环境下的迁移量升高。

表2 不同食品类别的覆膜金属罐中物质的迁移量Table 2 Migration results of substances in polymer-laminated metal cans of different food categories （μg/dm2）

2.6 TTC安全评估

由PBT和PET环状低聚物的结构可知, 其不含具有水解、还原、增强毒性的功能基团, 而含有氧原子的芳香杂环。根据Toxtree评估结果, PBT和PET低聚物的结构均为CramerⅢ类, 可能会有毒性或活性功能基团, 阈值为1. 5μg/kg·BW/d。

根据食物平均摄入量（水果罐头、饮料和啤酒分别为0. 006 5、0. 005 3、0. 014 kg·BW/d）、迁移量（表2）和平均S/V（表3）调查结果, 按“1. 4”中的公式计算与不同类别食品接触的覆膜金属罐中PBT和PET环状低聚物的膳食暴露量（μg/kg·BW/d）。由表4可知, 接触饮料食品的覆膜金属罐中的PET环状三聚体的膳食暴露量最大, 为1. 234μg/kg·BW/d；接触水果罐头食品的覆膜金属罐中的PET环状四聚体和接触啤酒食品的覆膜金属罐中的PET环状五聚体的膳食暴露量最小, 为0. 001μg/kg·BW/d。3类食品接触的覆膜金属罐中PBT和PET环状低聚物的膳食暴露量均低于TTC阈值。因此, 普通人群通过摄入覆膜金属罐包装的上述3类食品暴露于PBT和PET环状低聚物所引起的健康风险较低, 不需要引起健康关注。

表3 不同类别食品接触覆膜金属罐材质时的S/VTable 3 S/V of different types of food contacted with polymer-laminated metal cans materials

表4 普通人群对PBT和PET环状低聚物的膳食暴露量Table 4 General population dietary exposure to PBT and PET cyclic oligomers （μg/kg·BW/d）

由于本研究膳食摄入量调查中的调查对象、调查区域未能覆盖全国居民的食物消费情况；此外, 市场上覆膜金属罐包装的食品不断变化, S/V调查未能涵盖市场上所有类别的食品。因此, 本次评估所用的膳食摄入量数据和S/V数据可能会影响风险评估结果的准确性, 有待通过扩大调查范围进一步改进。

3 结 论

本研究建立了一种UPLC-QTOF MS测定覆膜金属罐包装食品中PET和PBT环状低聚物迁移量的方法, 基于我国食物消费量调查和S/V的调查, 采用TTC决策树方法, 首次对水果罐头、饮料和啤酒3类食品覆膜金属罐中可能迁移出的PBT和PET环状低聚物开展风险评估。评估结果表明, 我国普通人群通过摄入覆膜金属罐包装的上述3类食品暴露于PBT和PET环状低聚物的风险处于可接受水平。该方法快速高效, 在食品接触材料、食用香料等的风险评估方面拥有广阔的应用前景。