中亚热带红壤不同粒级有机质的化学特征及其对有机培肥的响应

燕明蕊，李冬初，张会民，娄翼来，王义东

（1.天津师范大学 天津市水资源与水环境重点实验室，天津 300387；2.天津师范大学地理与环境科学学院，天津 300387；3.中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081；4.中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北京 100081）

土壤有机质（soil organic matter，SOM）是土壤肥力、作物生产和生态环境功能的基础要素，其作用发挥取决于有机质的数量、化学结构与成分等[1].植物残体是土壤有机质的主要输入源，其在微生物作用下，一部分被分解、修饰和释放（以CO2形式）；另一部分被利用、合成和转化，从而改变有机质的性质与组成.性质各异的有机质与各类土壤矿质的结合及稳定机制也不相同，即有机质与矿物之间发生了“选择性复合分馏”[2].物理保护（微团聚体中有机质与矿物的组合及包裹体）是土壤有机质的主要稳定机制. 有机质具有明显的组分特征，其中，颗粒有机质（POM）与矿质结合有机质（MOM）的特征差异明显[3]：颗粒有机质一般分解程度低，碳氮比（C/N）高，更容易受到环境变化的影响[4-5]；矿质结合有机质的特性则相反[6-7].颗粒有机质有2 种尺寸等级，即粗颗粒（cPOM，>250 μm）和细颗粒（fPOM，53～250 μm）[8]，细颗粒含有游离和微聚集体闭塞的部分，被认为是粗颗粒分解和碎片化的产物[9].施用矿质肥料和有机肥是农业生产中常用的农田管理措施，施肥可以影响土壤有机质的含量和化学特征.如Bol 等[10]研究发现，施肥方式会在一定程度上影响土壤有机质中含氮化合物（氨基氮、杂环氮等）的含量；周萍等[11]研究发现，长期施肥可以改变有机质的分子结构，有机无机配施能增强土壤有机质的稳定性.土壤有机质的化学特征在粒级尺度上对有机培肥方式（秸秆还田和粪肥）的响应尚未得到充分研究.

本研究以中亚热带红壤区土壤为研究对象，通过元素分析仪和热裂解-气相色谱/质谱（Py-GC/MS）技术分别对不同粒级的土壤有机质进行碳、氮含量以及化合物组成的测定和分析，探究有机培肥制度下不同粒级土壤有机质含量与化学特征的分异规律及响应方式，为进一步了解土壤-植被-微生物的综合调控机制提供依据.

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于湖南省祁阳县的中国农业科学院红壤实验站（26°45′N，111°52′E），属中亚热带季风气候，年均气温18 ℃，年降水量1 255 mm，年蒸发量1 470 mm，无霜期约300 d，年日照时数1 610 h.供试土壤为旱地红壤，成土母质为第四纪红土，种植制度为小麦-玉米轮作，一年两熟.1990 年实验开始时，0～20 cm 土层土壤的理化性质为：pH 值为5.7，有机碳含量为6.67 g/kg，总氮含量为1.07 g/kg，总磷含量为1.03 g/kg，总钾含量为13.3 g/kg，碱解氮含量为79 mg/kg，速效磷含量为10.8 mg/kg，速效钾含量为122 mg/kg.

1.2 实验设计与样品采集

实验共设置3 种处理：①施氮磷钾复合肥（NPK）；②秸秆还田并施氮磷钾复合肥（NPKS）；③施氮磷钾复合肥与有机肥（NPKM）.每个小区面积为196 m2，随机排列，无灌溉设施.每年施肥量：300 kg/hm2氮肥（N）、52.4 kg/hm2磷肥（P）、97.5 kg/hm2钾肥（K），所有施氮小区氮肥用量相同.NPKM 处理组中有机肥为猪粪（平均含N 量为16.7 g/kg），有机氮施用量为210 kg/hm2，占总氮的70%，不考虑磷、钾养分.玉米季肥料施用量占全年施用量的70%，小麦季施用量占30%.有机肥在小麦、玉米播种前作为基肥一次性施用.

2017 年夏季作物收获前采集0～20 cm 土层的土壤样品.每种处理设置3 个重复，每个重复小区内采用“S”型取样法随机选取5 个点采集样品，混匀后小心带回实验室，运输过程中注意不破坏土壤结构.样品带回实验室后置于室温下风干，去除植物碎屑、根系和石头碎片等杂质，过2 mm 筛后保存备用.

1.3 土壤有机碳分组和碳、氮含量测定

采用Six 等[9]的方法对土壤进行粒级分组：称量25 g 土样倒入100 mL 实验塑料方瓶中，放入25 颗直径为4 mm 的玻璃珠，并加入60 mL 超纯水浸没样品，在振荡器上振荡1 h（25 ℃，180 r/min）.将振荡完成的土样混合液过250 μm 的土壤筛，用超纯水将筛上部分冲洗至水流澄清，收集筛上的土样至铝盒中，烘干至恒重（60 ℃），待冷却后称重，该部分土样即为有机碳粗颗粒组分（cPOM）.将筛下部分土样用超纯水冲至大铝盒中，烘干至恒重（60 ℃），将烘干样品转移至100 mL塑料瓶中，加入25 颗玻璃珠和六偏磷酸钠溶液（60 mL，5 g/L），在振荡器上振荡18 h（25 ℃，180 r/min）. 将振荡完成的土样过53 μm 筛，用超纯水将筛上部分冲洗至水流澄清，分别收集筛上和筛下部分到铝盒中，烘干至恒重（60 ℃）.筛上部分为有机碳细颗粒组分（fPOM），筛下部分为有机碳矿质结合组分（MOM）.利用元素分析仪（PerkinElmer 2400 Ⅱ型，美国）测定全土和各粒级组分样品中的有机碳（SOC）及总氮（TN）含量，每个样品平行测定3 次.

1.4 基于Py-GC/MS 技术的土壤有机质化学成分测定

基于Py-GC/MS 技术，利用单点裂解器（Frontier Laboratories Ltd，日本）与气相色谱-质谱联用仪（GC/MS，QP-2010Ultra，日本）测定土样的化学成分.称取5 mg充分研磨后的样品放置于白金小舟内，用自由落体方式将样品舟跌落至裂解温度为550 ℃的石英裂解管中，用相连的气相色谱-质谱联用仪对裂解产物进行分离与鉴定.利用NIST11 质谱库对裂解产物的化学结构进行检索与判定，基于测得的总离子流色谱图上谱峰的面积，采用归一法计算裂解产物的相对含量.GC/MS分析的色谱条件为：色谱柱DB-5（30 m×0.25 mm×0.25 μm），柱流量为0.80 mL/min，分流比为100∶1，载气为He，初始柱温为40 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 速率升温至260 ℃后保持5 min.质谱条件：电子轰击离子源（EI），离子温度为300 ℃，电子能量为70 eV，全扫描模式，质荷比（m/z）扫描范围为29～500.

本研究共鉴别出288 种化合物，将其划分为10类：脂肪族化合物、单环芳香烃、多环芳香烃、木质素、酚类化合物、多糖、氨基酸氮、杂环氮、其他含氮化合物、其他化合物.由于在热解过程中氨基酸容易被误转为吲哚、咪唑、吡嗪、吡啶、吡咯和腈[12-13]，为减少错误分类的影响，将这6 种化合物归类为氨基酸氮，将具有复杂分子结构的化合物以及含P、F、Cl、Br、Li 和Si元素的化合物归类为其他化合物.根据文献[14-16]，这些热解化合物根据来源可被分为：植物来源、微生物来源和多重来源（植物+微生物）化合物.植物来源化合物包括长链脂类（＞C26）、木质素、酚类化合物、多糖、氨基酸氮（吡嗪、吲哚）和杂环氮；微生物来源化合物包括短链脂类（＜C16）、芳香族（单环和多环）、氨基酸氮（吡咯、吡啶、咪唑、腈）和其他含氮化合物；多重来源化合物包括一些未指明的脂类（C16～C26）.

1.5 数据分析

利用Excle 2016 和SPSS 17.0 对数据进行统计分析，采用SPSS 中单因素方差分析（one-way ANOVA）的Tukey 多重比较对不同施肥方式下不同粒级土壤的差异进行检验（P ＜0.05），用对应分析（Correspondence Analysis）解释变量之间的关系，利用Origin 2018 进行作图.计算3 个重复处理数据的均值，采用标准误差.

2 结果与分析

2.1 土壤不同粒级组分占比

不同施肥方式下土壤各粒级组分的质量分数如图1 所示.

图1 不同处理组中土壤3 种粒级组分的质量分数Fig.1 Mass fraction of the three particle size classes in different treatments

由图1 可以看出，同NPK 处理组相比，NPKM 处理组中粗颗粒的质量分数显著增加（P ＜0.05），矿质结合组分的质量分数显著降低（P ＜0.05），细颗粒组分的质量分数没有显著变化（P ＞0.05）.NPKS 处理组中各粒级组分的质量分数与NPK 处理组之间的差异不具有统计学意义（P ＞0.05）.同种施肥方式下各粒级组分的质量分数排序为：矿质结合组分＞粗颗粒＞细颗粒，且3 种粒级之间的差异具有统计学意义（P ＜0.05）.

2.2 土壤有机碳、总氮含量及碳氮比（C/N）

不同施肥方式下土壤各粒级组分的有机碳、总氮含量以及碳氮比的情况如图2 所示.由图2 可以看出，同1990 年实验开始时土壤的有机碳含量（6.67 g/kg）相比，实验27 a 的有机培肥制度（秸秆还田与施加有机肥）分别使全土有机碳含量增加了97.6%和163.8%.由图2（a）和图2（b）可以看出，同NPK 处理组相比，NPKM 处理组中全土、细颗粒和矿质结合组分的有机碳与总氮含量均显著增加（P ＜0.05）；在粗颗粒组分中，秸秆还田和施加有机肥均提高了有机碳和总氮的含量，但同NPK 处理组相比，差异不具有统计学意义（P ＞0.05）.从土壤粒级来看，同一施肥方式下3 种粒级土壤之间的有机碳与总氮含量的差异均具有统计学意义（P ＜0.05），由大到小排序均为：矿质结合组分＞粗颗粒＞细颗粒. 由图2（c）可以看出，在细颗粒组分中，秸秆还田处理的C/N 显著高于施加有机肥的C/N，前者比后者高32%. 同一施肥方式下不同粒级土壤C/N 之间的差异具有统计学意义（P ＜0.05），且由大到小排序均为：细颗粒＞粗颗粒＞矿质结合组分.

图2 不同处理组中土壤有机碳、总氮含量及碳氮比Fig.2 SOC content，TN content and C/N ratio of soil in different treatments

2.3 土壤有机质化学组分特征

不同施肥方式下土壤各粒级组分的有机质化学组成如图3 所示.

图3 不同处理组中土壤有机质的化学组成Fig.3 Chemical composition of SOM in different treatments

由图3 可以看出，3 个粒级组分中，有机培肥方式对粗颗粒和矿质结合组分中土壤有机质化学组成的影响不明显.细颗粒中，NPKM 处理组中木质素的相对丰度显著高于NPK 和NPKS 处理组的数值；NPKS 处理组的氨基酸氮相对丰度显著高于NPKM 处理组的数值（P ＜0.05）.粒级分异也影响了土壤有机质的化学组成.单环芳香烃、木质素和多糖较多地存在于粗颗粒和细颗粒组分中；而含氮化合物（尤其是氨基酸氮）则更多地存在于矿质结合组分中.相比于矿质结合组分，单环芳香烃在粗颗粒中的相对丰度（NPK、NPKS、NPKM 之和）增加了137%，木质素在粗颗粒和细颗粒中的相对丰度（NPK、NPKS、NPKM 之和）分别增加了592%和406%.含氮化合物在矿质结合组分中的相对丰度（NPK、NPKS、NPKM 之和）相比于粗颗粒和细颗粒分别增加了213%和375%.整体来看，同有机培肥方式相比，粒级分异对有机质化合物组成的影响更大.

不同施肥方式下各粒级土壤化学组成之间的对应分析如图4 所示.由图4 可以看出，全土和矿质结合组分基本分布在左侧，粗颗粒和细颗粒基本分布在右侧，说明不同粒级组分之间土壤化学组成的差异具有统计学意义（P ＜0.05）.与此对应，多环芳香烃、酚类化合物、含氮化合物（氨基酸氮、杂环氮和其他含氮化合物）集中分布在左侧，脂肪族化合物、单环芳香烃、木质素、多糖集中分布在右侧，因此认为各粒级土壤化学组成之间的差异具有统计学意义（P ＜0.05）.粗颗粒分布在上部，NPK 处理组的全土和细颗粒、NPKS 处理组的矿质结合组分分布在下部.化合物类型中芳香烃类物质、酚类化合物、含氮化合物均分布在上方，脂肪族、木质素、多糖均分布在下方. 这说明粗颗粒和细颗粒之间化学组成的差异具有统计学意义（P ＜0.05），以木质素为主；全土和矿质结合组分的化学组成较为相似，没有明显差异且均以酚类化合物和含氮化合物为主.综合来看，中亚热带红壤的化学组成主要受粒级影响且有一定的差异.

图4 有机培肥制度下的粒级与化学组成之间的对应分析Fig.4 Correspondence analysis of particle size and chemical composition under organic fertilization regimes

2.4 土壤有机质来源的分布特征

不同施肥方式下不同粒级土壤的热解化合物来源分布如图5 所示.由图5 可知，NPKM 处理组中，粗颗粒和细颗粒中植物来源化合物相对丰度均显著高于矿质结合组分中的数值；粗颗粒中微生物来源化合物相对丰度显著高于细颗粒中的数值；矿质结合组分中多重来源化合物相对丰度显著高于粗颗粒和细颗粒中的数值.有机培肥方式主要影响了细颗粒中植物来源化合物的含量，表现为NPKM＞NPK＞NPKS.

图5 热解化合物来源分布Fig.5 Probable origins of pyrolysis products

不同施肥方式下不同粒级土壤有机质热解化合物的对应分析如图6 所示.由图6 可以看出，全土和矿质结合组分中多重来源化合物的分布较多，粗颗粒中植物来源和微生物来源化合物的分布较多.通过对应分析发现，不同施肥方式之间没有明显的分区，表明不同施肥方式下研究区土壤的化合物来源较为相似，差异不具有统计学意义（P ＞0.05）.

图6 有机培肥制度下粒级与热解产物来源的对应分析Fig.6 Correspondence analysis of particle size and origins of pyrolysis products under organic fertilization regimes

3 讨论与结论

农田系统的碳投入主要来自作物根系及其分泌物、根系残茬、秸秆还田和有机肥投入.本研究中的样地位于中亚热带地区，水热充足，土壤主要由第四纪红色黏土等成土母质发育而成[17]，土壤中有机碳和总氮的物质来源相对单一.通过27 a 的长期定位实验发现，秸秆还田和施加有机肥2 种有机培肥处理分别使样地的有机碳含量增加了97.6%和163.8%，表明有机培肥可以增加土壤有机质的含量，且施加有机肥的效果更好.在施加有机肥处理下，土壤粗颗粒与细颗粒组分相对含量增加，说明颗粒态有机质对有机肥的敏感性更强，可能是因为牲畜粪肥中含有消化后未分解的植物残体（主要指颗粒态有机质）.矿质结合有机碳在土壤中的周转速率缓慢，含量相对较高，有利于土壤有机碳的稳定与固存，通常被认为是土壤碳库中的惰性碳库[18]，本研究结果与之相符，即矿质结合组分在土壤中的相对含量最高.此外，本研究发现有机碳和总氮主要分布在矿质结合组分中，这归因于该粒级组分的持久性停留（周转时间较长）[19]和较高的质量分数（>80%），粒级调节了土壤有机碳和总氮在基质中的定位.研究表明，有机培肥（秸秆还田和施用有机肥）对土壤的碳、氮含量有重要影响[20].本研究发现施加有机肥显著提高了细颗粒和矿质结合组分中有机碳和总氮的含量，这可能是由于作物生长较好，粪肥或根系生物量的投入直接影响土壤中的营养成分含量，从而改变了土壤中酶和微生物活性以及根系活动，使土壤产生更多的有机代谢物质，增加了碳、氮含量[21].此外，亚热带温度较高，土壤酸性较强，土壤颗粒表面电荷少，有机质与土壤颗粒结合能力低，所受物理保护较弱，更容易被微生物利用分解；有机质分解往往是吸热过程，亚热带的高温会促进植物残体和有机质的转化，增加土壤腐殖质成分和提高土壤碳、氮含量. 其他长期（10～100 a）施加有机肥农田土壤的研究也得出了类似结果[22].粗颗粒主要来源于植物，可能已经受到部分微生物的分解作用，所以有机培肥制度没有显著增加其中的有机碳和总氮含量.本研究中细颗粒组分有机碳和总氮含量的增幅最大，证实了细颗粒是施肥特别是粪肥管理下有机碳变化的重要指标.

C/N 反映了土壤储存和循环养分的能力，通常数值越高表示有机物质的分解程度越低.本研究中全土的C/N 较低，可能是因为随着有机物质分解过程的进行，C 在呼吸过程中被释放，虽然部分矿化的N 通过淋溶或气体排放而丢失，但其他部分矿化的N 重新进入了土壤有机质[23]，导致全土的C/N 较低.细颗粒的C/N最高，粗颗粒的C/N 也较高，表明其中的微生物衍生化合物较少，并且受到了微团聚体的部分保护[8]，因此有机物质的分解程度较低. 矿质结合组分的C/N 最低，表明该组分的腐殖化程度最高.细颗粒中，秸秆还田处理的C/N 显著高于有机肥处理的C/N，可能是因为秸秆分解不彻底，而有机肥处理下的土壤微生物作用强，分解程度高.

在土壤有机质的化学组成中，从植物残渣中提取的芳香烃和木质素较难降解.本研究中粗颗粒和细颗粒组分富集了顽固的芳香烃（尤其是单环芳香烃）和木质素，这是因为芳香烃和木质素在颗粒组分中的分解程度低于在矿质结合组分中的分解程度[9，16]，且细颗粒组分被微团聚体部分吸附从而阻挡了分解[8].矿质结合组分的含氮化合物（主要是氨基氮和杂环氮）含量较高，这与Kleber 等[2]和Kopittke 等[24]的研究结果一致，可能是由于矿质结合组分积累了较多的微生物坏死产物[25]，这些产物容易被黏土矿物紧密吸附并形成有机矿物缔合，从而延长它们在土壤中的停留时间[2，6].同粒级分异相比，有机培肥方式对土壤粗颗粒和矿质结合组分中有机质化学特征的影响并不显著，但是对细颗粒组分的影响相对较大，尤其是对细颗粒组分中的木质素.木质素来源于植物残渣（细胞壁），一部分木质素在动物消化和微生物代谢过程中被保留[26]，因此在施加有机肥条件下细颗粒组分的木质素含量较高，秸秆还田方式下这种影响不明显.颗粒态组分与矿质结合组分在微生物来源化合物的比例方面没有显著差异，这可能与红壤区特殊的土壤性质有关，红壤旱地酸度大，易分解.粗颗粒中植物碳输入通过微生物的处理和同化，从而转化为微生物衍生的碳[25].有机肥施用也影响了有机质中化合物的来源，细颗粒中有机肥的施加显著增加了植物来源化合物含量，而秸秆还田相对减少了植物来源化合物含量，主要与其中木质素含量的增减有关.

综合来看，中亚热带红壤中矿质结合组分的质量分数最高，其次是粗颗粒组分，细颗粒组分的质量分数最低.粒级组分对有机碳、总氮含量以及化合物的组成特征（脂肪族化合物、芳香族化合物、木质素、含氮化合物等）起主要调控作用，而有机培肥的影响相对较小.同秸秆还田相比，施用有机肥更能提高土壤中有机碳的含量.粗颗粒与细颗粒组分中芳香烃和木质素的含量较高，矿质结合组分中含氮化合物（尤其是氨基酸氮）的含量较高.