高组胺鱼罐头中5种生物胺含量的LC-MS分析方法

杨清华，史玉坤，戴志英，蔡秀丽，施逸岚，张卫兵

南通市疾病预防控制中心（南通 226002）

生物胺广泛存在于日常生活的食品中，适量的生物胺对人体有益，但是高浓度的生物胺会对人体产生严重的毒害作用，其中组胺是毒性最强的生物胺，其次是尸胺和酪胺[1-3]。水产品是生物胺的主要研究领域，特别高组胺鱼类[4]因组胺含量高是重点研究对象。高组胺鱼经常会被加工成鱼罐头而被人们喜爱。但是在鱼罐头的生产加工过程需要多种程序从而引起生物胺含量的变化，尤其是组胺和酪胺的变化最大，所以加强对高组胺鱼罐头中生物胺含量的监测和分析对于人们的饮食健康有着重要的意义[5-8]。

目前已有多种方法应用于生物胺的检测，主要有紫外可见分光光度法[9]、高效液相色谱法（LC）[10-11]、气相色谱质谱法（GC-MS）[12]、离子色谱法[13]和液相质谱法（LC-MS）[14-15]。LC法作为GB 5009.208—2016[16]中第一法，其定量限较高，且需要衍生化处理，步骤相对繁琐，分析时间长，增加了检测的不确定性因素。液质联用法具有灵敏度高、定性准确等优点，逐渐被广泛应用，文献中与该方法联用的前处理手段主要有固相萃取、分散固相萃取以及QuEChERS提取等[17-20]，研究建立了高氯酸消解与LC-MS/MS联用检测鱼罐头中生物胺的方法，该方法具有操作简单、灵敏度高、重现性好和有机试剂消耗少等优点，可以满足鱼罐头样品中生物胺的定性和定量分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标准品：尸胺（纯度＞98%）、腐胺盐酸盐（纯度＞99%）、酪胺盐酸盐（纯度＞98%）、色胺（纯度＞98%）、组胺盐酸盐（纯度＞99%）：上海安谱实验科技股份有限公司；甲醇（色谱纯，默克）；甲酸铵（色谱级，阿拉丁）；三氯乙酸（分析纯，国药）；高氯酸（纯度约为70%，国药）；氢氧化钠（试剂纯，国药）；鱼肉粉中组胺残留量检测质控样品（CFAPA-QC056B-1，452.8±64.9 mg/kg，大连中食国实检测技术有限公司）；甲酸（LC-MS级，Fluka）；PTFE针式过滤器（0.22 μm，Agilent）。

1.2 仪器与设备

API 3200三重四极杆串联液相色谱质谱仪（AB公司，美国）；UFLCXR超快速液相色谱仪（岛津，日本）；Primo R高速冷冻离心机（Thermo Fisher公司，美国）；JY10002型电子分析天平（梅特勒，瑞士）；试验用水均来自Mili-Q纯水系统（Milipore公司，美国）；Vortex1旋涡混匀仪（IKV，德国）。

1.3 方法

1.3.1 标准和溶液的配制

分别称取10.0 mg 5种生物胺标准品，用乙腈溶解并定容至100 mL容量瓶中，制得100 μg/mL的混合标准储备液；用乙腈稀释配制标准质量浓度分别为1.0，2.5，5.0，10.0，20.0，50.0和100.0 μg/L的系列标准工作溶液；100 mL 5%高氯酸溶液是由7.1 mL高氯乙酸加92.9 mL纯水配制得到的，0.5%的高氯酸是由5%高氯酸溶液十倍稀释所得。

1.3.2 试样制备

从江苏、北京以及广东不同省份采集以70份鲭鱼、鲣鱼、金枪鱼、秋刀鱼、马鲛鱼、鲅鱼、青占鱼、沙丁鱼等高组胺鱼做成的罐头样品，弃去油汁取可食部分的鱼肉，将其切碎，用组织捣碎机捣碎将其装入洁净的盛样容器，密封并做好标记，于-20 ℃冷冻保存，尽快检测。

1.3.3 样品的提取净化

称取2 g（精确至0.01 g）粉碎的鱼肉样品于50 mL离心管中，加入15 mL 5%高氯酸溶液，均质旋涡5 min，冰浴超声20 min，后静置20 min，按8 000 r/min离心10 min后将上清液转移至另一50 mL容量瓶中；样品残渣再加入15 mL 5%高氯酸溶液重复提取1次，合并上清液。往上述上清液中加入适量400 g/L氢氧化钠溶液，用pH试纸调节pH至2～3，再用0.5%高氯酸溶液定容至50 mL。准确移取2 mL上述溶液至离心管，加入2 mL 0.5%高氯酸溶液，加5 mL正己烷，振荡混匀，离心，弃去正己烷层；再加入5 mL正己烷净化，弃去正己烷层。吸取0.25 mL上述溶液于玻璃管中，加入0.75 mL乙腈，混匀过0.22 μm滤膜，供液相色谱-串联质谱仪测定，对于高浓度的样品需要逐级稀释至线性范围进行检测分析。

1.3.4 仪器条件

液相条件：色谱柱：waters Atlantis HILIC silica（3 μm，2.1 mm×100 mm）；流动相：A相为含10 mmol/L甲酸铵，0.5%甲酸的水溶液；B相为含10 mmol/L甲酸铵的0.5%甲酸的乙腈溶液；柱温：35 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：5 μL。梯度洗脱情况见表1。

表1 流动相的梯度变化

质谱条件：Turbo V离子源；电离方式：ESI正离子模式；定量检测方式：多反应监测模式（MRM）；气帘气压力CUS：30.0 psi；碰撞气压力CAS：8 psi；电喷雾电压IS：5 500 V；去溶剂温度：500 ℃；雾化器压力GS1：50 psi；辅助气压力GS2：50 psi。碰撞室入口电压（EP）：10.0 V；碰撞室出口电压（CXP）：3.0 V；检测方式为多反应监测模式（MRM），优化后的母离子、子离子和碰撞能量见表2。

表2 5种生物胺的MRM分析条件

1.4 数据处理

采用Origin统计分析软件进行数据分析。

定性分析：在相同色谱条件和质谱条件下，对着生物胺的标准品定性离子对以及出峰时间，对样品中的生物胺进行定性分析。

定量分析：通过生物胺定量离子的峰面积以及标准的线性回归方程，按照式（1）计算样品中生物胺的含量（mg/kg）。

式中：c为标准曲线上得到生物胺的质量浓度，μg/L；m为鱼肉的样量，g。

2 结果与分析

2.1 质谱参数优化

在电喷雾正离子方式下，对100 μg/L的生物胺标准溶液进行一极质谱扫描（Q1），得到分子离子，即母离子；对被测物的分子离子碰撞后，进行二极质谱分析，得到子离子质谱图。通过优化去簇电压和碰撞气电压等参数，以达到最佳灵敏度。5种生物胺的MRM图见图1。

图1 5种生物胺的标准MRM图谱

2.2 提取条件优化

2.2.1 提取溶剂选择

生物胺具有强极性及较好的水溶性，所以采用极性强的溶剂提取，一般使用三氯乙酸（TCA）、甲酸、乙腈、甲醇和高氯酸溶液进行提取[20-22]，鱼罐头是一类高蛋白腌制品，提取生物胺前需要消解蛋白质，酸解法是一种简便快捷的蛋白质消解方法，常用消解试剂有TCA和高氯酸；另外罐头中含有较多的油和盐分，因此试验过程中需要通过正己烷去除油脂。研究以实际检出5种生物胺的鲅鱼罐头样品进行不同提取溶剂的提取效果分析，样品分别经5% TCA、2.5% TCA-2.5%高氯酸混合溶液和5%高氯酸溶液进行消解提取，再经正己烷去除脂肪净化，三种提取溶液对提取效果的影响见图2。结果表明，当提取溶剂为5%三氯乙酸和2.5%三氯乙酸-2.5%高氯酸溶液时酪胺、腐胺和组胺的检出浓度较低，所以选择5%高氯酸对实际鱼罐头样品中5种生物胺进行提取。

表3 三种提取溶剂对生物胺提取效率的影响（n=3）

2.2.2 提取溶剂浓度选择

方法使用高氯酸对鱼肉进行蛋白质沉淀和生物胺提取，所以高氯酸浓度对生物胺的提取效率影响较大。该方法考察了鱼罐头样品在不同浓度高氯酸溶液中的提取效率，结果见图2。生物胺提取效率是以不同浓度高氯酸消解样品后测定生物胺的含量与表2中5%高氯酸溶液提取时测得生物胺含量的比值（%）来表示。结果表明，高氯酸质量浓度从1%到8%升高时，生物胺的提取效果变高，尤其是对于腐胺组分，随着高氯酸浓度的增加，提取效率增加明显，但是当高氯酸浓度高于5%时，5种生物胺提取效率虽有所增加，但是考虑到高氯酸浓度较高，会给LC-MS/MS带来较多损害和干扰，所以选择5%高氯酸进行样品消解。

图2 不同浓度高氯酸对5种生物胺提取效率的影响

2.3 方法验证

2.3.1 基质效应

基质效应（matrix effect，ME）指样品处理过程中除目标化合物外，其他组分对定量分析准确性和重现性的影响。ME采用公式（2）计算：

式中：km为基质匹配校准曲线的斜率，k为溶剂校准曲线的斜率。

参照步骤1.2.3小节处理过程提取空白鱼罐头基质溶液，分别用乙腈和空白基质溶液配制相同浓度的工作液，按LC-MS/MS的检测条件进行分析测定。以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制基质匹配校准曲线和溶剂校准曲线，并计算每种生物胺的基质效应，其中5种生物胺的ME值在0.86～1.0范围内，表明该方法的基质效应不明显。因此，采用乙腈溶剂的校准曲线外标法对样品进行定量分析。

2.3.2 线性关系与检出限

采用外标法对“1.2.1小节”方法制备的1.0，2.5，5.0，10，20，50和100 μg/L系列标准工作溶液进行上机检测，以生物胺的峰面为纵坐标，生物胺的质量浓度为横坐标绘制标准曲线，5种生物胺的相关线性r均大于0.99。按照定性离子通道中信噪比（rSN）不小于3时在实际样品中目标化合物的浓度为检出限，定量离子通道中信噪比（rSN）不小于10时在实际样品中目标化合物的浓度为定量限。该法生物胺的检出限（rLOD）和定量限（rLQD）在0.31～4.1 mg/kg和1.0～13.6 mg/kg范围内。

2.3.3 质控样的测定

准确称取2 g鱼粉质控样品（CFAPA-QC056B- 1），前处理同1.2.3小节，平行处理6次，取平均值，测得鱼粉中组胺含量的平均值为409.2 mg/kg，在质控样证书质量分数452.8±64.9 mg/kg范围内，说明方法的准确性良好。

2.3.4 方法的回收率和精密度

开展某鲅鱼罐头样品的加标和精密度试验，准确称取2 g粉碎的鱼肉样品，分别进行5，50和100 mg/kg三个不同质量分数水平的加标回收试验，每个质量分数水平需要独立检测6次，计算其加标回收率和相对标准偏差，结果见表4。其中加标回收率在76.0%～ 108%范围内，相对标准偏差在2.89%～5.08%范围内，说明该方法的准确度和精密度良好。

表4 加标回收率和相对标准偏差（n=6）

2.4 样品测定

分别应用该方法对70份高组胺类鱼罐头进行生物胺含量的检测分析，5种生物胺的总含量在未检出（ND）～652.9 mg/kg范围内，每种生物胺的含量结果见图4。每种罐头中单生物胺的含量大部分＜50 mg/kg，色胺的检出质量分数在ND～56.5 mg/kg范围内；酪胺的检出质量分数在ND～381.5 mg/kg范围内；组胺的检出质量分数在ND～330.5 mg/kg范围内；尸胺的检出质量分数在ND～198.3 mg/kg范围内；腐胺的检出质量分数在ND～217.6 mg/kg范围内。目前尚未有针对高组胺鱼罐头中生物胺的检测分析报道，只有研究测定部分金枪鱼、沙丁鱼以及鲭鱼品种罐头中组胺的含量，有报道沙丁鱼罐头中组胺含量在ND～354.05 mg/kg之间，金枪鱼罐头中组胺含量在ND～197.47 mg/kg之间；鲭鱼罐头中组胺含量在ND～64.05 mg/kg[23-24]之间。研究测定结果与文献报道基本在相同水平范围内。

图3 5种生物胺在高组胺鱼罐头样品中的结果统计

3 讨论与结论

研究优化了提取试剂种类和浓度对鱼罐头样品中生物胺提取效果的影响，建立了5种生物胺的高氯酸消解与LC-MS/MS联用的检测方法，检出限和定量限分别0.31～4.1 mg/kg和1.0～13.6 mg/kg之间，5种生物胺化合物的回收率在76.0%～108%之间，方法简便、准确、灵敏、分析时间短，完全满足对鱼罐头样品中多种生物胺的同时检测分析。

将所建方法应用于70份不同品种高组胺鱼罐头中生物胺含量的检测分析，经检测验证，完全能满足检测需求，该方法的组胺检测结果与文献报道的高组胺鱼罐头中组胺含量相近。方法在定性和灵敏度方面明显优于国标方法，克服了分光光度法和液相色谱法检测过程繁琐、准确度差、检出限高等缺点，既简化了前处理步骤，又在保证准确度的前提下，减少了大量有毒溶剂的使用，适用于鱼罐头中生物胺的定性和定量分析。