QuEChERS-UPLC-MS/MS法快速测定苹果中304种农药残留

何成军，成长玉，钟慈平，姚欢，杜钢，余晓琴

四川省食品检验研究院（成都 611731）

苹果是我国最重要的落叶果树之一。据国家统计局公布的数据，2021年我国苹果总产量达4 597.34万 t。苹果营养价值高、热量低，富含多种矿物质和维生素，是人们经常食用的水果之一。苹果在种植过程中容易遭受多种病虫害[1-5]。截至2019年10月，国内苹果共登记6 012种农药，其中现行有效产品2 463种[6]，登记量总体处于较高水平。部分果农为控制病害、增加产量而出现多种农药滥用、乱用的情况屡有发生，从而导致农残超标，危害消费者健康。因此，建立一种通用、快速、高效的多种农药残留快速筛查的检测方法具有十分重要的现实意义。

农药残留检测方法主要有气相色谱法[7]、高效液相色谱法[8]、气相色谱-串联质谱法[9-11]、超高效液相色谱-串联质谱法[12-14]和飞行时间质谱[15-17]，由于超高效液相色谱-串联质谱法具有高效、快速、灵敏、高选择性和高通量等优点，该方法是国内外农药残留检测最主要的检测方法之一[18-20]。QuEChERS方法具有简便、快捷、经济、高效、安全等优点，自发布以来，获得美国分析化学家协会、欧盟等多个国际机构认可，被广泛应用于食品中农药残留分析[21]。

选择QuEChERS提取和净化作为前处理，结合灵敏度高、抗干扰能力强且普及率高的超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱仪，对苹果中多种农药残留进行快速筛查和确证。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

苹果样品购于本地市场；304种农药混合标准品（质量浓度均为10 μg/mL，阿尔塔科技有限公司）；乙腈、甲醇（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）；甲酸、甲酸铵（色谱纯，天津市科密欧化学试剂公司）；试验用水为超纯水。

Agilent 1260 Infinity II超高效液相色谱仪、Agilent 6470三重四极杆质谱仪，配有电喷雾离子源（ESI）（美国Agilent公司）；Heraeus Multifuge X3R高速冷冻台式离心机、Barnstead Gen Pure超纯水机（美国Thermo Fisher公司）；XSE 105分析天平（瑞士Mettler公司）；N1全自动氮吹浓缩仪（上海屹尧仪器科技发展有限公司）。

1.2 样品前处理

精密称取10 g经粉碎的样品，置于50 mL离心管中，加入一颗陶瓷均质子，再精密加入10 mL乙腈，加入QuEChERS提取包，振荡提取2 min后按6 000 r/min离心5 min，将上清液转移至另一离心管中，残渣加入10 mL乙腈重复提取1次，将2次提取液合并。准确移取6 mL提取液至15 mL具塞离心管中，加入QuEChERS净化包，涡旋1 min，按6 000 r/min离心5 min后，精密吸取5 mL上清液于40 ℃氮吹至近干，加入1 mL乙腈涡旋溶解，经0.22 μm滤膜过滤，待超高效液相色谱-质谱联用仪分析。

1.3 超高效液相色谱-质谱条件

1.3.1 液相色谱条件

色谱柱Agilent ZORBAX Eclipse C18（150 mm×4.6 mm，1.8 μm）色谱柱；流动相A为5 mmol/L甲酸铵含0.1%甲酸水溶液，流动相B为含0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序：0～0.5 min，90% A；0.5～3.0 min，90%～50% A；3.0～20.0 min，50%～0% A；20.0～24.0min，0% A；24.0～24.1 min，0.0%～90% A；24.1～27.0 min，90% A；流速0.40 mL/min；柱温40 ℃；进样量2.0 μL。

1.3.2 质谱条件

离子源为电喷雾离子源（ESI）；负离子（ESI-）与正离子（ESI+）模式同时采集；检测方式为动态多反应检测（DMRM）；干燥气温度300 ℃；干燥气流量5 L/min；鞘气温度250 ℃；鞘气流量11 L/min；毛细管电压3 500 V；各农药化合物的质谱MRM图见图1。

图1 有机溶剂中304种农药混合标准溶液（500 ng/mL）的MRM色谱图

1.4 标准溶液的配制及标准曲线

1.4.1 农药混合标准储备液

分别取适量混合农药标准品，置于同一10 mL容量瓶中，用甲醇稀释并定容至刻度。制成1 000 ng/mL的标准品储备溶液，置于-18 ℃冰箱避光储存。

1.4.2 基质匹配混合标准工作溶液

取苹果空白样品，按照1.2小节的处理方法制得空白基质溶液，加入适量上述混合标准溶液，稀释成10，50，100，200和500 ng/mL的系列基质匹配混合农药标准工作溶液，上机测定，绘制标准工作曲线，现用现配。

2 结果与分析

2.1 色谱条件的优化

由于304种化合物的结构差异较大，因此选择性能优异、稳定性好、载样量高和分离度优异的Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18超高效液相色谱柱。并且考察长度100 mm和150 mm的色谱柱的分离效果。结果显示，304种农药化合物在Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，1.8 μm）上以较为理想的保留时间得到理想的分离效果。

2.2 质谱条件的选择

从304种农药化合物的结构可以看出，其中的大部分化合物会进行电喷雾正离子模式电离，一小部分进行电喷雾负离子模式电离。质谱数据显示，304种农药中有4种化合物（除虫脲、氟虫腈、氟苯脲、氟虫脲）采用负离子模式进行扫描，另外300种化合物采用正离子模式进行扫描。由于快速筛查方法需要在较短时间内尽可能多地检测化合物，所以采用正、负离子同时进行采集的模式较为适用。同时，在确定各化合物保留时间的基础上，质谱采用动态多反应模式监测，在化合物保留时间±30 s内扫描，提高了各化合物的灵敏度和定性准确性。

2.3 质谱数据库的建立与优化

配制304种农药的混合标准溶液（500 ng/mL），采用仪器自动进样方式，优化每种农药质谱参数，获得最佳的碎裂电压和碰撞能量，确定每个化合物的保留时间，选取2组灵敏度最佳的离子对进行检测，一组用来定量，另一组辅助定性。为了兼顾各化物不同的电离方式，采用正、负离子同时扫描模式进行检测，建立农药化合物的MRM数据库，部分数据见表1。

表1 118种农药的保留时间和定性、定量离子对、碰撞电压、裂碎电压、相关系数、回收率和精密度

接表1

接表1

2.4 样品前处理方法的选择

对于多种化合物的通用快速前处理方法选择，既要考虑大部分化合物的回收率，又要兼顾样品基质的净化，减少杂质的影响。以乙腈作为提取溶剂，既可以有效地提取样品中的目标化合物，也能使样品中的蛋白质变性沉淀，可以减少蛋白质对样品分析的干扰。无水硫酸镁能除去样品溶液中的水分，PSA能去除样品溶液中的小部分色素和大部分有机酸和糖类，GCB能吸附样品溶液中的大部分色素杂质。结果表明，使用QuEChERS提取包（含4 g MgSO4、1 g NaCl、1 g二水合柠檬酸三钠和0.5 g半水柠檬酸氢二钠）和QuEChERS净化包（含150 mg PSA、15 mg GCB和885 mg MgSO4），对苹果样品溶液进行提取和净化，各化合物色谱峰无干扰峰，回收率为73.7%～115.9%，能够满足快速筛查的前处理要求。

2.5 线性范围和定量限

称取6份空白苹果样品，按1.2小节的样品前处理方法处理得到空白基质溶液，并配制质量浓度分别为10，50，100，200和500 ng/mL的基质匹配标准工作溶液。在已经优化的色谱和质谱条件下测定，以质量浓度（x，ng/mL）为横坐标，各农药化合物的峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线。结果显示，304种农药在10～500 ng/mL范围内均呈现出良好的线性关系，相关系数均在0.995以上。

2.6 回收率与精密度

向空白苹果样品中准确加入适量304种农药标准品储备溶液，制备3个添加水平（10，40和80 μg/kg）的加标回收样品，每个水平制备6个平行样（n=6）。按照1.2小节的处理方法，按照1.3小节的方法分析，基质匹配外标法定量，计算加标回收率和相对标准偏差。结果表明，304种农药化合物的平均回收率为73.7%～115.9%，相对标准偏差为0.5%～17.9%（n=6）。

2.7 方法的验证与结果

2020年中国检疫科学研究院组织了高通量非靶向农药残留筛查能力评价，评价包括定性筛查和准确定量两个方面的内容。将此次建立的快速筛查方法测定能力验证提供的苹果样品，对样品中的未知农药进行定性筛查和准确定量，评估该方法的定性可靠性和定量准确性。

定性筛查要求在组织方提供的农药化合物清单中筛查出所添加的农药化合物种类，并且要求对所筛出的农药化合物进行准确定量。应用该方法从能力验证样品中筛查出12种农药（定量结果见表2），并采用相应的标准品进行进一步的准确定量。结果表明，建立的方法对苹果中农药残留的定性能力强，与组织方公布的农药种类完全一致，而且定量结果准确可靠，所有筛查出的化合物的定量结果z值均小于2，结果为满意。

表2 苹果中高通量非靶向农药残留筛查能力验证结果

3 结论与讨论

此次试验将QuEChERS前处理技术与超高效液相色谱-串联三重四极杆质谱相结合，对苹果中的多种农药进行定性筛查和定量分析；建立了苹果中304种农药的质谱数据库，用于多种农药残留的快速筛查和确证。将所建立的方法应用于2020年中国检疫科学研究院组织的高通量非靶向农药残留筛查能力评价，定性和定量结果均为满意。该方法具有简单、快速、高效、准确的特点，在较短时间内即可完成样品的前处理及上机测定，实现对苹果样品中304种农药残留的快速筛查和准确定量。

另外，该方法中有118种农药化合物（质谱参数见表1，占本方法化合物的38.8%）在2021年9月3日实施的GB 23200.121—2021《食品安全国家标准 植物源性食品中331种农药及其代谢物残留量的测定 液相色谱-质谱联用法》中没有涵盖。这些化合物的正确度和精密度均符合农业部2386号公告[22]中的相关要求，且该方法的前处理与该标准中蔬菜、水果等样品的前处理方法基本一致，可以考虑将该方法所提供的质谱参数等相关信息应用于国家标准的进一步提升，以期为食品安全监管应急检验提供有力的技术支撑。