藤茶植物TLC鉴别方法及指纹图谱的建立

凌伟红，陈燕，冯淼，王超纯，田春莲

1. 吉首大学林产化工工程湖南省重点实验室（张家界 427000）；2. 张家界市永定区农业农村局（张家界 427000）

藤茶是由葡萄科蛇葡萄属显齿蛇葡萄（Ampelopsis grossedentataW.T.Wang）的茎叶加工而成的类茶，又名莓茶、白茶、甘露茶，作为保健茶和中草药已有数百年的应用历史[1-3]，具有治疗黄疸、咽喉肿痛和抗动脉粥状样硬化等功效[4-5]，其二氢杨梅素、杨梅素和杨梅苷是藤茶主要的活性物质[6]，具有抗氧化、抑菌、解酒护肝等活性[7-9]。此外，在2019年新冠肺炎疫情中，张家界市人民医院以藤茶为主药预防和治疗新冠肺炎的效果显著[10]。

但羽叶蛇葡萄和广东蛇葡萄嫩茎叶也用于制作“藤茶”，这导致市场上同名不同品，同品不同名的现象，因此，需要一种高效快速的方法来辨别原料，而TLC以高效便捷、分析成本低的优势在中草药鉴定、食品安全等领域被广泛应用，如沙棘、金银花、麦冬的品质评价中均有报道[11-13]，藤茶TLC在湖南、福建和广西地方标准均采用不同的薄层展开体系，另有何桂霞等[14-15]以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（10∶8∶5）为展开剂对藤茶杨梅素和二氢杨梅素定量分析，但展开剂中均使用了易制毒试剂，这限制了TLC在藤茶原料植物评价中的应用。此外，应用TLC评价不同品种与不同区域的藤茶原料植物鲜有报道。因此，此次试验在优化TLC条件的基础上评价不同区域藤茶原料植物的优劣，以期为藤茶原料的质量评价提供有效便捷的检测技术。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

DSA300-GL1型超声波清洗仪（福州德森精工有限公司）；ATS4薄层色谱自动点样仪和TLC Visualizer 2薄层成像仪（瑞士卡玛公司）；GF254薄层板（乳山市太阳干燥剂有限公司）；FA1004万分之一电子天平（上海舜宇恒平仪器有限公司）；GLM101型鼓风干燥箱（武汉格莱莫检测设备有限公司）。

二氢杨梅素（纯度≥98%，批号20190610，中国生物制品检定所）；杨梅素（纯度≥98%，批号L1623059，上海麦克林生化科技有限公司）；杨梅苷（纯度≥98%，批号202012-201218，中原植提标准品实验耗材中心）；石油醚、乙酸乙酯、甲醇、乙醇、正丁醇、乙酸、甲酸（均为分析纯）；水（自制超纯水）。样品2021年5—6月采自湖南、湖北、广西、云南四省16个不同产地的66个藤茶原料嫩茎叶，经吉首大学廖博儒研究员鉴定S51为羽叶蛇葡萄，S52、S54为广东蛇葡萄，其他均为显齿蛇葡萄，取其5～7 cm嫩茎叶，经50 ℃烘箱干燥，粉碎并过0.425 mm（40目）孔径筛，常温干燥备用。样品采集时间及编号见表1。

表1 显齿蛇葡萄和其近缘植物样品信息

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

准确称取0.2 g样品干燥粉末，参照汲军等[16]藤茶超声提取黄酮工艺，并稍作修改。加10 mL提取溶剂，于60 ℃超声提取30 min，加提取溶剂补足至10 mL，经0.45 μm有机膜过滤，放置4 ℃冰箱中避光保存。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取适量杨梅素、二氢杨梅素和杨梅苷对照品，分别以50%甲醇溶解定容至10 mL，制成质量浓度分别为0.24，0.11和0.23 mg/mL的对照品溶液；精密量取适量杨梅素、二氢杨梅素和杨梅苷对照品溶液，以50%甲醇溶解并定容至10 mL，制成质量浓度分别为0.30，0.13和0.23 mg/mL的混合对照品溶液，于4 ℃避光保存。

2.3 TLC条件考察

2.3.1 不同展开剂的考察

比较甲醇-水（1∶1，V/V）[17]、甲醇-醋酸-水（90∶5∶5，V/V）[18]、乙醇-水-甲酸（3∶3∶1，V/V）[19]、石油醚-乙酸乙酯-甲酸（17∶13∶0.3，V/V）[20]4种展开剂，结果发现前3种展开时间长，溶剂前沿连成一线且斑点数量少，而石油醚-乙酸乙酯-甲酸（17∶13∶0.3，V/V）展开效果较好，但此展开剂下二氢杨梅素和杨梅苷的比移值（Rf）较低，不利于观察。因此试验考虑加入适量正丁醇调节甲酸比例以优化展开体系。

2.3.2 展开剂比例的考察

配制展开体系：①石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶0.5，V/V）；②石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1，V/V）；③石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）；④石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶2，V/V）；⑤石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶2.5，V/V），在室温下饱和15 min后分别吸取5 μL供试液点在硅胶GF254薄层板上，分别在上述3种不同展开系中展开，取出，晾干，喷1% AlCl3乙醇溶液，热风吹干，于365 nm检视。结果显示，展开系统①，②和⑤的分离效果不如展开系统③和④，展开系统③条带更为清晰，因此，选择展开系统③作为藤茶原料植物薄层鉴别的展开剂。

2.3.3 显色剂的选择

取37号供试品溶液及混合对照品溶液，各5 μL，点在高效硅胶 GF254薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）为展开剂，展开，分别用不同显色剂进行显色。①10%硫酸乙醇溶液显色。将展开后的薄层板浸入10%硫酸乙醇溶液，取出晾干后于80 ℃加热至斑点显现，置紫外灯（365 nm）下视检。②1% AlCl3乙醇溶液显色。喷1% AlCl3溶液至薄层板，热风吹干，置紫外灯（365 nm）下视检。③10%磷钼酸溶液显色。将展开后的薄层板浸入10%磷钼酸溶液，取出晾干后于80 ℃加热至斑点显现，置白光下视检。 结果表明，在紫外灯视检下，1% AlCl3乙醇溶液显色后能单独检视所有的特征条带，而10%磷钼酸溶液和10%硫酸乙醇溶液视检需加热显色，操作不便，加热终点难以控制，条带不清晰，不便于观察，故选择1% AlCl3乙醇溶液为显色剂。

2.3.4 提取溶剂的考察

选择50%，80%，100%甲醇和75%，95%，无水乙醇为提取溶剂，按照2.1.1小节的方法制备相应供试液，分别取5 μL供试液，依次点样在同一薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）为展开剂，上行展开，取出，晾干，喷1%AlCl3乙醇溶液，热风吹干，于365 nm视检。结果显示，50%甲醇提取的供试液薄层图谱色素斑点少，而100%甲醇提取的供试液TLC图斑点清晰，其他溶剂提取差异不明显。因此，选100%甲醇为显齿蛇葡萄活性成分的提取溶剂。

2.3.5 点样量的考察

分别吸取2，4，6，8，10和12 μL的供试液以6nm为点样宽度在同一薄层板上点样，以石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）为展开剂，上行展开，点样量2 μL时杨梅素条带未显出，说明点样量少，其杨梅素含量达不到检出限，而点样量超过6 μL时条带出现，但条带边界不清晰，杨梅苷与杨梅素开始拖尾，所以点样量为5 μL。

2.3.6 点样宽度的考察

吸取5 μL供试液，分别以3，4，5，6，7和8 mm为点样宽度在薄层板上点样，展开显色后，在365 nm紫外光下观察，结果发现不同点样宽度对样品分离效果有影响，点样宽度在5，6和7 mm处条带较清晰，点样宽度增加，条带逐渐模糊。故选择6 mm为最佳点样宽度。

2.3.7 展开温度的考察

将3块点有样品的薄层板分别放入在4 ℃，40 ℃与室温的展开缸中，上行展开，显色观察。试验表明，40 ℃薄层板展开时间长且边界模糊，4 ℃低温下展开条带更为分明，但展开时间长，且图谱与室温下展开的区别不大，因此试验在室温下进行即可。

2.3.8 展开湿度的考察

在上述确定的TLC条件下，使用不同浓度的硫酸水溶液控制层析缸湿度，即展开缸内相对湿度控制在30%，40%，50%和60%。将点有供试液的4块薄层板分别在不同湿度下展开，结果发现湿度区间内薄层斑点的Rf值变化不大，故薄层展开湿度在30%～60%均可进行，无须严格控制湿度。

2.3.9 稳定性考察

按2.1.1小节制备样液，每隔2 h点样1次，分别在制备样液后的0，2，4，6和8 h后点样于同一薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）为展开剂展开，显色后在365 nm下检视，结果发现此时间内样品TLC无明显变化，说明样品液稳定性较好。

2.4 不同省份显齿蛇葡萄的TLC鉴别

采用已建立的TLC最佳条件评价来自湖南、湖北、广西、云南4 省份的显齿蛇葡萄样本，结果如图1所示。在供试品溶液色谱图中，样品与对照品显现相同颜色荧光斑点的位置相对应。对不同地区而言，云南（S14～S15）二氢杨梅素明显低于其他地区，在杨梅苷与二氢杨梅素间无其他条带，杨梅素与二氢杨梅素间未出现蓝色条带，而广西（S16～S17）在Rf=0.2处出现暗黄色条带，Rf=0.53处可见蓝色未知成分条带，推测广西藤茶原料植物的化学成分较为丰富。湖南、湖北两省所采样品的化学成分相近，二氢杨梅素含量明显高于其他省份，其中湖北样品大约在Rf=0.51处蓝色荧光斑点明亮，湖南同一产区显齿蛇葡萄中杨梅素条带亮度随海拔升高而增强，如S18～S20采自海拔380～1 103 m的湖南双牌，以S19杨梅素条带亮度最强。因此，TLC可客观评价不同省份的显齿蛇葡萄资源。

图1 不同省份显齿蛇葡萄的TLC

2.5 显齿蛇葡萄及近缘植物的TLC鉴别

选择不同品种藤茶原料样品进行TLC鉴别。S48～S50为3家馆种植的大叶莓、小叶莓和白莓。S51～S54为湖北来凤产区，在供试品色谱中，S51，S52和S54杨梅素斑点未显现出，S51约在Rf=0.8处多1个黄色荧光斑点，杨梅苷上方多1个蓝色荧光斑点，二氢杨梅素斑点未显现。S48，S49，S50和S53杨梅素、二氢杨梅素、杨梅苷均有对应斑点，其中S48大叶莓中杨梅苷亮度明显低于其他样品，S49小叶莓二氢杨梅素斑点最大，在Rf=0.21处淡黄色荧光斑点亮度呈现为大叶莓＜小叶莓＜白莓。S48～S50均在Rf=0.1处有蓝色荧光斑点，广东蛇葡萄S52与S54呈现出相同颜色的斑点且斑点数相同。

2.6 湖南湘西产区显齿蛇葡萄的TLC鉴别

采用2.3小节的方法评价39批湖南湘西不同区域的显齿蛇葡萄样品，结果如图2所示。以各共有峰的峰面积为指标，采用ChemPattern软件，进行PCA并选方差贡献率较大的2个主成分聚类分析，得图4（图4中样品序列号对应图3中样品轨道序列）。由图4（A）发现，除S44、S46、S62外的36批样品分为2类，其中S36，S38，S39，S65和S66为Ⅰ类，其他样品为Ⅱ类，地理位置越近，样品聚集度越高。3个主成分中，PC1=25.07%，PC2=18.79%，PC3=16.82%，共占比60.68%。从图4（B）可看出，三家馆、青安坪、罗塔坪、王家坪均聚集在一起，说明这4个产区的原料质量稳定。沅古坪、王家坪和温塘产区内差异大，可能与区域内环境有关，教字垭PC1成分差异明显，应该由产区海拔引起，200～500 m之间海拔越高，PC1含量越高。总之，所有样品均富含二氢杨梅素、杨梅素及杨梅苷，其中以S44、S61样品中杨梅素含量明显高于其他产区，S46号样品二氢杨梅素明显高于其他产区，可以推断湘西地区由于地势地貌差异大、海拔等因素不同对显齿蛇葡萄的化学成分含量存在一定的影响。

图2 不同品种藤茶原料的TLC

图3 湖南湘西地区显齿蛇葡萄的TLC

图4 湖南湘西地区显齿蛇葡萄的TLC聚类分析（A）与主成分分析（B）

2.7 显齿蛇葡萄TLC共有模式的确定

藤茶原料植物的薄层分析图导入ChemPattern软件，手动设定轨道，调节轨道位置和宽度，将图形转化为灰度曲线，得到叠加图谱和共有模式，根据Rf值确定6个样品共有峰，生成叠加图谱并形成共有模式（如图4所示）。不同产区峰面积的SRSD值相差较大（均＞3%），由于藤茶的地理来源、生长的环境和管理模式不尽相同，因此呈现出活性成分的含量与种类差异较大，而对于相同品种和相同地理来源的藤茶活性成分是相近的。故TLC指纹图谱可作为藤茶原料的质量控制方法。

图5 藤茶原料植物TLC指纹图谱

3 讨论与结论

3.1 讨论

黄酮成分是藤茶原料植物的主要活性成分，而植物活性成分的积累与其生长环境密切相关，对不同区域及不同种属的藤茶原料植物开展TLC鉴定，尤其重点分析湘西地区的显齿蛇葡萄。试验发现地区、品种差异对黄酮成分影响显著。根据样品薄层色谱的斑点峰面积和Rf，建立的TLC指纹图谱可快速鉴别不同的藤茶原料植物，为藤茶的品质鉴定和质量评价提供依据。试验同时指认3种黄酮成分，展开体系中加入正丁醇能很好地分离显齿蛇葡萄黄酮，有别于传统的氯仿/甲苯/丙酮易制毒、毒性大的展开溶剂且仅鉴别2种黄酮成分[21-23]。此外，采用的化学计量学方法评价TLC数码轮廓具有定性与定量结合的优势，且聚类分析与PCA分析结果基本一致。TLC鉴别多使用对照品识别样品条斑对应的成分，可通过TLC了解药材中更多的化学成分，通过薄层-质谱技术推测条斑对应成分的结构。

3.2 结论

试验建立以石油醚-乙酸乙酯-正丁醇-甲酸（17∶13∶2∶1.5，V/V）为展开剂，饱和时间15 min，点样量5 μL，点样宽度6 mm，室温下的藤茶原料植物TLC鉴别方法。TLC图谱中Rf=0.075，Rf=0.58和Rf=0.63处显示清晰可见的黄色荧光斑点，分别与对照品杨梅苷、二氢杨梅素和杨梅素的斑点的Rf值相对应，且条带之间无影响，样品斑点清晰，分离较好，Rf值适中。所建立的TLC方法简便快速、结果直观，非常适合实际生产中大量样品的检测。但环境湿度、展开剂饱和程度等易导致Rf变动，在有对照品参照下对鉴别的影响较小。

66批样品薄层分析发现，相同产地、不同海拔的显齿蛇葡萄化学成分差异不明显，而杨梅素的含量随海拔增加而增加，不同省份的显齿蛇葡萄黄酮含量存在明显差异，高低顺序为湖南＞广西＞云南。不同蛇葡萄属植物黄酮含量呈现为显齿蛇葡萄＞广东蛇葡萄＞羽叶蛇葡萄。