基于营养成分和主成分分析的驴肉与其他肉类分类研究

牛晓颖，牟晓晴，孙杰,，张春江，赵志磊，田特

(1.河北大学 质量技术监督学院，河北 保定 071002；2.中国农业科学院 农产品加工研究所，农业农村部农产品加工综合性重点实验室，北京 100193)

驴肉营养丰富、风味独特，兼具多种医疗保健价值，深受广大消费者喜爱[1].由于中国肉驴集约化养殖规模不大，同时市场需求较大，导致生驴存栏量逐年下降[2].驴肉稀缺，从而使驴肉价格较高，生鲜驴肉目前市场价在120元/kg左右，比猪、牛、羊肉等普遍高100%以上.为牟取较高的利润，驴肉市场存在掺假问题，损害消费者权益，也给食品安全带来隐患.目前，对肉类进行鉴别的方法主要包括基于形态学、代谢物、核酸及蛋白质的检测方法[3-6].使用的技术有液质联用/气质联用[7-9]、聚合酶链反应[10-14]、DNA条形码[15-16]、近红外光谱[17-21]等，与其他畜禽肉相比，驴肉营养价值高，具有高蛋白、高人体必需氨基酸、高不饱和脂肪酸及低脂肪、低胆固醇、低热量的特点[22-23]，但检测驴肉和其他肉类的营养成分含量，并据此进行分类的研究报道较少.在已应用的鉴别方法和技术中，近红外光谱法与其他方法相比，具有快速、无损的特点，但作为间接方法，无法对鉴别结果进行机理解释，对肉类样品的营养成分进行检测并进行区别分析也可以作为近红外光谱法的解释和补充.本文使用索氏抽提法和凯氏定氮法分别检测了样品的肌间脂肪和蛋白质含量，采用气相色谱法检测了样品的多种脂肪酸，并使用阳离子交换色谱分离、茚三酮柱后衍生法对样品的多种氨基酸含量进行了检测.对驴肉和其他肉类样品的脂肪、蛋白质、12种脂肪酸、17种氨基酸及总氨基酸含量进行了单因素方差分析，对不同差异水平的指标组合分别进行了主成分分析，筛选了对驴肉和其他肉类样品分类的有效营养成分组合.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

40个生鲜驴肉样品(取自不同个体样本的不同部位，购自保定市永茂驴肉)，生鲜猪肉、牛肉、羊肉样品各8个，购自保定时代超市；实验前将样品上的脂肪和筋膜尽量去除干净，使用绞肉机搅碎成肉糜备用，脂肪和蛋白质测定所使用的无水乙醚、无水硫酸钾、硫酸铜和浓硫酸等均为国产分析纯，脂肪酸及氨基酸测定所使用的标准品均为色谱纯.

1.2 仪器与设备

KJELTEC 2300全自动凯氏定氮仪(FOSS，丹麦)；SER148型脂肪测定仪(VECP公司，意大利)；GC7890气相色谱仪(Agilent，美国)；L-8900 型全自动氨基酸分析仪(Hitachi，日本)；绞肉机(名健MGC-090，中国).

1.3 方法

1.3.1 脂肪和蛋白质的检测

按照国家标准GB 5009.6——2016《食品中脂肪的测定》，称取充分混合均匀的肉糜样品2～5 g，使用索氏抽提法检测了样品的肌间脂肪含量；按照GB 5009.5——2016《食品中蛋白质的测定》，称取充分混合均匀的肉糜样品0.2～2 g，使用凯氏定氮法检测了样品的蛋白质含量.取3次平行样的平均值为样品含量数据.

1.3.2 脂肪酸的检测

按照国家标准GB/T 5413.27——2010《婴幼儿食品和乳品中脂肪酸的测定》中的方法制备样品，称取0.5 g左右的肉样于干燥螺口玻璃管中，加5 mL甲苯，再加6 mL乙酰氯甲醇，充氮1 min排出管内空气，旋紧螺旋盖，振荡混合后于80 ℃水浴中放置2 h，期间每隔20 min取出振荡一次，水浴后取出冷却至室温.将反应后的样液转移至50 mL离心管中，混匀，5 000 r/min离心5 min，取上清液，用甲苯稀释10倍后，混匀，过0.2 μm膜，待测.

气相色谱仪工作条件为色谱柱：固定液100%二氰丙基聚硅氧烷(100 m×0.25 mm，0.20 μm)；载气：氮气；载气流速：1.0 mL/min；进样口温度：260 ℃；分流比：30∶1；检测器温度：280 ℃；柱温箱温度：初始温度140 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升温至240 ℃，保持15 min；进样量：1.0 μL.

1.3.3 氨基酸的检测

使用酸水解的方法进行样品前处理，精密称取肉样(含50 mg蛋白)于水解管中，加入10 mL 6 mol/L的盐酸，充氮1 min排出管内空气，旋紧螺旋盖.将管放于110 ℃烘箱中水解24 h.取出样品冷却至室温后，混匀过滤，用去离子水充分清洗水解管，将全部样品转移并定容至50 mL容量瓶内.混匀后，吸取1 mL进行氮吹至吹干,后用0.02 mol/L盐酸复溶到5 mL，吸取1 mL水解液过0.2 μm滤膜到进样瓶中，参考文献[24-25]使用全自动氨基酸分析仪检测样品的17种氨基酸含量.

1.3.4 数据处理

使用SPSS 16.0(SPSS公司，美国)对驴肉和其他肉类样品的营养成分指标进行了单因素方差分析(one-way analysis of variance，one-way ANOVA)，使用MATLAB 7.0(MathWorks公司，美国)进行了主成分分析.

2 结果与分析

2.1 不同肉类样品营养成分含量差异分析

本节对驴肉、牛肉、羊肉和猪肉样品中的脂肪、蛋白质、脂肪酸和氨基酸指标分别进行了单因素方差分析.根据方差分析规定，若F>F0.01，认为不同肉类样品的该指标差异极显著，因此对分类的影响高度显著，作标记**；若F0.05

2.1.1 脂肪和蛋白质差异分析

表1为不同种类生鲜肉类样品脂肪和蛋白质指标的平均值±标准偏差、F值及F临界值，从表1中可以看出，不同样品的脂肪和蛋白质含量均在水平1%上具有显著差异，脂肪和蛋白质2个指标对不同种类生鲜肉样品分类的影响高度显著.

表1 不同肉类样品脂肪和蛋白质含量的平均值±标准偏差、F值及F0.01临界值Tab.1 Mean±standard deviation,F value and F0.01 of differences in crude fat and protein for different fresh meat samples

为进一步分析驴肉和其他肉类样品在脂肪和蛋白质指标上的差异，本节还分别对驴肉/牛肉，驴肉/羊肉及驴肉/猪肉样品进行了单因素方差分析，结果见表2.从表2中可以发现，驴肉/羊肉的脂肪含量差异极显著，和其他肉类样品的脂肪含量没有显著差异；驴肉/牛肉、驴肉/羊肉的蛋白质含量差异极显著，其中又以驴肉/羊肉的蛋白质含量差异最为显著，驴肉/猪肉的蛋白质含量没有显著差异.总体来看，驴肉样品的脂肪含量在4种肉类样品中处于较低水平，而蛋白质含量则处于较高水平.驴肉/猪肉的脂肪和蛋白质含量均无显著差异，这可能与本研究中猪肉样品的取样为通脊肉有关，猪通脊肉为猪脊椎骨内侧的条状嫩肉，为纯瘦肉，脂肪含量低、蛋白质含量高.

所以AC2(BD1·BD2)=AB2·BC2-AB2·BC·(BD1+BD2)+AB2(BD1·BD2)，

表2 驴肉和其他肉类样品脂肪和蛋白质的F值及F临界值Tab.2 F value and F critical values of differences in crude fat and protein for fresh meat samples of donkey and other species respectively

2.1.2 脂肪酸差异分析

本研究检测了24种脂肪酸在样品中的含量，其中肉豆蔻酸(C14:0)、十五碳酸(C15:0)、棕榈酸(C16:0)、棕榈油酸(C16:1n7)、硬脂酸(C18:0)、二十四碳一烯酸(C24:1n9)、亚油酸(C18:2n6c)、十七碳酸(C17:0)、反式油酸(C18:1n9t；C18:1n11t)和油酸(C18:1n9c)10种脂肪酸在样品中普遍存在，因此用于本部分的差异分析.样品的不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸含量通过对24个检测指标中相应类型的脂肪酸含量求和得到.

从表3中可以看出，不同样品的肉豆蔻酸、十五碳酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、油酸及不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸含量均在水平1%上具有极显著差异，说明这些指标对不同种类生鲜肉样品分类的影响高度显著.

对具有差异的脂肪酸指标进行了多重差异分析，如表4.驴肉/牛肉含量具有极显著差异的指标包括肉豆蔻酸、十五碳酸、棕榈酸、棕榈油酸、亚油酸及不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸；驴肉/羊肉含量具有极显著差异的指标有肉豆蔻酸、十五碳酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、油酸、不饱和脂肪酸和饱和脂肪酸；驴肉/猪肉含量具有极显著差异的仅有亚油酸，具有显著差异的有肉豆蔻酸、棕榈油酸、硬脂酸、二十四碳一烯酸和不饱和脂肪酸，说明亚油酸在驴肉/猪肉样品的分类中起到了关键作用.脂肪酸是脂肪的基本组成成分，2.1.1节中对脂肪含量差异的分析发现，驴肉/猪肉样品的脂肪含量不具有显著差异，这和表4中驴肉/猪肉样品的多个脂肪酸含量差异不显著的情况一致.

表4 驴肉和其他肉类样品脂肪酸的F值及F临界值Tab.4 F values and F critical values of differences in fatty acids for fresh meat samples of donkey and other species respectively

2.1.3 氨基酸差异分析

本研究检测了17种氨基酸在不同肉类样品中的含量.总氨基酸含量通过对游离氨基酸含量求和获得.从表5中可以看出，苏氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸和脯氨酸7种游离氨基酸对分类的影响显著；门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和总氨基酸7种氨基酸对分类有一定的影响；其他氨基酸对分类没有显著影响.总体来说，不同肉类氨基酸的含量差异不大，这可能与其含量普遍偏低有关.

表5 不同肉类样品氨基酸含量的平均值±标准偏差、F值及F临界值Tab.5 Mean±standard deviation,F value and F critical values of differences in amino acids for different fresh meat samples

对不同肉类样品具有差异的氨基酸指标含量进行了多重差异分析，如表6.从表6中可以看出，驴肉/牛肉的苏氨酸、丝氨酸、亮氨酸和赖氨酸含量具有显著差异，甘氨酸含量不具有显著差异，其他氨基酸含量均具有一定差异；驴肉/羊肉的组氨酸含量具有显著差异，门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、赖氨酸和总氨基酸含量具有一定差异，其他氨基酸不具有显著差异；驴肉/猪肉的脯氨酸含量具有显著差异，甘氨酸含量具有一定差异，其他氨基酸不具有显著差异.

表6 驴肉和其他肉类样品氨基酸的F值及F临界值Tab.6 F values and F critical values of differences in amino acids for fresh meat samples of donkey and other species respectively

2.2 不同差异水平指标的主成分分析

为进一步验证不同差异水平指标对不同肉类样品分类的影响，本节分别对具有极显著差异的11个指标(脂肪、蛋白质、肉豆蔻酸、十五碳酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、油酸及不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸)、具有显著差异的9个指标(二十四碳一烯酸、反式油酸、苏氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸和脯氨酸)、具有一定差异的7个指标(门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和总氨基酸)的浓度数据进行了主成分分析.

2.2.1 全部具有差异指标的主成分分析

对27个具有差异的指标数据提取了主成分，前3主成分累积贡献率达到82.18%，解释的差异超过80%，可用于代替原变量进行聚类趋势的分析.图1为前3主成分图，从图1中可以看出，牛肉、羊肉可以和驴肉清晰地区分开，而猪肉和驴肉样品混杂在一起，无法分开.根据3.1节的分析可知，驴肉和猪肉样品的各项指标差异较小，从而导致2种样品分类时发生了混叠，以下从不同差异水平指标的角度观察分类效果的改善情况.

2.2.2 极显著差异指标的主成分分析

对具有极显著差异的11个指标提取了主成分，前3主成分的累积贡献率达到79.49%，接近80%，可进行聚类分析.图2为差异极显著指标的前3主成分得分图，从图2中可以看出，4种不同的肉类样品呈现了明显的聚类趋势，驴肉和牛肉、羊肉样品可以清楚地区分开，但驴肉和猪肉样品有重叠现象.

图1 不同肉类样品具有差异指标数据前3主成分得分Fig.1 Different meat sample scores plot for PC1,PC2 and PC3 of chemical composition data with significant difference

图2 不同肉类样品差异极显著指标数据前3主成分得分Fig.2 Scores plot for PC1,PC2 and PC3 of chemical composition data with difference significant at 0.01 level

为进一步观察驴肉和其他肉类的区分情况，分别绘制了驴肉/牛肉、驴肉/羊肉的前2主成分得分图，及驴肉/猪肉的第2、3主成分得分图，见图3.从图3a和3b中可以发现，驴肉/牛肉、驴肉/羊肉的差异极显著指标前2 主成分有明显差异，可以进行清楚的区分.图3c驴肉/猪肉的第2和第3主成分二维图中，2类样品的区分比图2的三维图更加清晰，聚类趋势更加明显，没有出现三维图中的重叠现象，说明第2和第3比第1主成分得分包含有更多两类数据的差异特征.

a.驴肉/牛肉;b.驴肉/羊肉;c.驴肉/猪肉.图3 不同肉类样品差异极显著指标数据主成分得分二维图Fig.3 2-dimension scores plot of chemical composition data with difference significant at 0.01 level

2.2.3 显著差异指标的主成分分析

图4 不同肉类样品差异显著指标数据前3主成分得分Fig.4 Scores plot for PC1,PC2 and PC3 of chemical composition data with difference significant at 0.05 level

对具有显著差异的9个指标提取了主成分，前3主成分的累积贡献率达到98.98%.图4为显著差异指标的前3主成分得分图，从图4中可以发现，4种样品有聚类趋势，但与极显著差异指标主成分图2相比，其他肉类样品的重叠现象更加严重，驴肉样品也有一部分和牛肉、羊肉样品重叠在一起.为进一步观察本部分指标对驴肉和不同肉类样品分类的影响，使用所提取的主成分得分进行了驴肉和其他肉类样品的二维分析，见图5.与三维图相比，从图5中可以更加清楚地观察驴肉和其他肉类的重叠情况，可以发现，驴肉样品中有一小部分样品与牛肉、羊肉和猪肉样品均有所重叠，说明这些样品的二十四碳一烯酸、反式油酸、苏氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸和脯氨酸这9个指标的浓度数据特征较为相似.总体来说，差异显著指标的分类效果明显不如差异极显著指标.

本文还提取了有一定差异的门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和总氨基酸7个指标的主成分，绘制前3主成分三维图后发现不同肉类样品完全混杂在一起，没有明显的聚类趋势.说明在水平1%上具有显著差异的指标不适合用于不同肉类样品的鉴别，其差异不足以将不同肉类样品区别开来.

a.驴肉和牛肉;b.驴肉和羊肉;c.驴肉和猪肉.图5 不同肉类样品差异显著指标数据主成分得分二维图Fig.5 2-dimension scores plot of PC1 and PC2 with difference significant at 0.05 level

3 结论

本文使用单因素方差分析对脂肪、蛋白质、12种脂肪酸、18种氨基酸共32个指标在不同肉类样品中的含量差异进行了分析，差异极显著的指标有脂肪、蛋白质、9种脂肪酸(肉豆蔻酸、十五碳酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、油酸及不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸)；差异显著的有2种脂肪酸(二十四碳一烯酸、反式油酸)、7种氨基酸(苏氨酸、丝氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、组氨酸和脯氨酸)；有一定差异的有门冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、酪氨酸、精氨酸和总氨基酸7种氨基酸；没有显著差异的有十七碳酸、胱氨酸、缬氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸.

对驴肉、猪肉、牛肉和羊肉样品营养成分中不同差异水平的指标进行了主成分分析发现：具有极显著差异的指标提取主成分后对驴肉和其他肉类的区分效果最好，可以达到完全分开.极显著差异指标包括脂肪、蛋白质、肉豆蔻酸、十五碳酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、亚油酸、油酸及不饱和脂肪酸、饱和脂肪酸，是驴肉和其他肉类分类的关键成分，其中脂肪、脂肪酸类指标占绝大部分.根据文献[1,26]可知，脂肪及其脂肪酸组成结构是形成肉类独特风味的重要原因和来源，因此，使用脂肪、脂肪酸类指标在样品中的含量数据进行鉴别分析，即使用不同肉类样品独特风味化合物的组成结构特征对其进行鉴别.而不同肉类样品的风味特征有所区别，因此能够区分开来.