病毒哪里藏——核酸检测金标准

高耿欣，陈建成

1南京大学新生书院安邦书院，南京 210023

2南京大学化学化工学院，南京 210023

2022年春，新冠疫情在国内卷土重来。大学生小何通过与同学和医护人员的交流，逐步了解了核酸检测的原理，明白了核酸检测被称为新冠病毒检测“金标准”的原因。

1 全民核酸

“小何，排队的人好多呀，还要等多长时间才轮到我们采样呀？”同学小智不停地向小何抱怨着。

小何往前看去，核酸检测点前，人们排着长长的队伍，缓慢地前进。

来势汹汹的疫情又一次爆发在小何所在的城市。为了应对突然爆发的疫情，所有人被紧急通知前来接受核酸检测。

“今天好热，排队等待核酸检测真难受啊！难道核酸检测的过程非常复杂吗？不然为什么队伍前进的速度这么慢！”小何很是疑惑。

“整个检测过程确实很复杂，不过我们参与完成的其实只是检测最简单的第一部分，麻烦的是实验室检测过程。”小智解释道。

“啊，我不太了解呢。”小何挠挠头，虽然接受过很多次核酸检测，但是它的原理是什么，小何并不知道。

还没来得及向小智请教，队伍前面一阵熙熙攘攘的声音引起了小何的注意。

“小伙子啊，我这个确实不会用，不能做核酸检测吗？”排在前面的一个老人着急地向医护人员问道。

“老人家，核酸检测得提前预约啊，您找人帮您预约一下，再来检测，好吗？”

原来是一位老人家不会使用智能手机，没有提前在网上进行预约，所以被医护人员拦了下来。

“小何你看，在网上提前预约，再到采样点进行采样，这样的流程对我们而言很简单，但是对于那些不会上网的老人家来说，是非常不方便的。”小智感叹道。

“为什么不上门检测？就是医护人员到家里来采样？这样我们就不用冒着这么热的天来参加了。”

“没有你想的那么简单。我们的城市有这么多人口，而医护人员和志愿者的数量是十分有限的，都采取上门采样不现实。更何况，在这次紧急的疫情中，时间就是生命，上门检测效率太低，没法达到时效性。”

“可是你看我们在这里排队，等待时间长不说，人员也非常聚集，万一有病毒感染者，不是非常危险吗？”小何问道。

“这确实是避免不了的问题，大规模的集中核酸检测效率高，但是难免导致人员聚集，带来感染的风险，所以我们必须戴好口罩，站在‘一米线’外，尽量做好防护！”

“好了，到我们了，先采样吧。”

2 核酸检测——金标准

“搞定！明天应该可以在手机上查询到检测的结果。”

“刚刚你说了，疫情中时间就是生命，那这段时间的等待在疫情中其实还蛮长的！”小何感叹道。

完成了核酸采样，回寝室的路上，回想刚刚接受核酸采样的经历，小何做了许多思考。核酸检测其实有许多不便之处：网上预约不方便；排队非常消耗时间；集中采样有较高的感染风险；得到结果的时间较长。但人们都说，核酸检测是检测新冠病毒的“金标准”。

除了小智说的集中大规模采样效率高，核酸检测还有哪些特点，使其成为了病毒检测的“金标准”？

“小智，你能给我讲讲核酸检测的原理吗？”

“好呀！其实我们参与的只是核酸检测的第一步：采样。

医护人员用咽拭子在我们喉咙里擦拭，其实是在采取呼吸道上皮细胞样本。这是因为新冠病毒可以存活在我们的呼吸道细胞中。还有一种拭子是从鼻咽取样，叫作鼻拭子。”

“可是那一点点的样品怎么能检测出有没有感染病毒呢？”小何想到医护人员只采了那么一点点样品，不禁担心道。

“不用担心，要想解释这个问题，就必须提到样品检测的具体过程。目前检测新冠病毒常用的是一种名为RT-PCR实时荧光法的基因检测方法。

大体上来说，这是一种尝试精确复制基因并判断目的基因是否存在的技术。医护人员采集到的样品首先需要在实验室中纯化提取，得到核酸。如果被测样品含有病毒，那么病毒的核酸就可以被扩增并通过实时荧光法检测到。

了解这个方法的具体操作之前，我们得先知道RT，PCR和实时荧光分别是什么。

RT是Reverse Transcription的简称，即反转录。由于新冠病毒是RNA单链病毒，想要大量扩增其核酸，首先需要在反转录酶的作用下反转录产生双链结构的cDNA。cDNA的两条单链符合核苷酸的碱基互补配对原则，在氢键的连接下形成双螺旋结构。

PCR是Polymerase Chain Reaction的简称，即DNA聚合酶链式反应，是扩增基因的主要过程。在反应体系中，核苷酸原料在聚合酶的催化和引物的引导下，利用碱基互补配对原则与模板基因配对产生大量副本。如果把某段基因的扩增比作复印一本书中的某一部分内容，PCR反应就是在复印机上复印的过程。需要扩增的目的基因序列就是一本书；DNA聚合酶就像是复印机的打印喷头，复印得到的内容从聚合酶产出；游离的各种核苷酸像是复印所需要的各种颜色的墨水，是这个扩增反应的原料；根据特定目的基因序列设计出的正向引物和反向引物就像是用来标记复印起点和终点的书签，限制着复印的范围。

荧光探针，本质上是一小段可以和目的基因互补配对结合的基因序列，它应位于正向引物和反向引物之间。在这一小段的基因序列两端，分别含有一个荧光信号源和信号淬灭剂。在特定光照下，荧光信号源会发出相应的荧光信号；而如果它的附近有信号淬灭剂，那么荧光就会被吸收。这种荧光淬灭机制使得这个探针在保持完整的时候是不会发出荧光信号的。一旦荧光信号源处于游离状态，它发出的荧光就可以被检测到[3]。”

听过小智的简单介绍，小何似乎更加困惑了。

“那我们不妨用具体的反应过程来说明，”小智看出了小何的困惑。

“假设被测的样品是含有病毒的。

首先是反转录过程。在反转录酶的作用下，样品中的病毒RNA转化成为双链的cDNA。

然后是PCR反应过程。PCR总共分为三个步骤[1,2]。

第一步，变性。被送入PCR反应体系的cDNA在95 °C的高温下断开成为两条单链，使得核酸的碱基可以暴露出来。

第二步，退火。这个过程中，温度降低到55 °C左右。针对目的基因设计的引物可以连接到病毒的单链DNA上。与此同时，“探针书签”——荧光探针也会结合到目标基因序列的相应互补位置上。引物就像是一个书签，标记了在PCR过程中目的基因的位置，确定了复制的范围。病毒核酸的复制过程在正向引物结合的地方正向开始，在反向引物结合的地方反向开始，于是复制被限制在这两端引物之间。这样复制出的部分就是我们需要的目的基因片段。

可能你会疑惑，我们为什么要设计引物来限制复制的片段呢？直接把整条核酸全部复制下来不可以吗？其实设计引物的目的有以下两点：第一，引物是DNA聚合酶结合的位置，所以没有引物反应是没法发生的；第二，正向反向两种引物的限制可以节约反应原料。

第三步，延伸。反应温度再次被升高到72 °C左右，激活体系中的DNA聚合酶。聚合酶分别从正向引物和反向引物处开始不断接入核苷酸，延伸新的核酸链。而在延伸的过程中，触碰到两个引物之间的荧光探针，导致荧光信号源游离出来，淬灭机制被破坏，使得荧光可以显现。

PCR不断重复变性、退火、延伸的过程。本来极少量的病毒核酸会在一次一次的循环中以指数形式实现数量的增长。这个过程正如图1所示。”

图1 PCR反应原理图

“哦，我明白了！原来PCR反应中，病毒核酸的数量是指数爆炸式的增长啊！那么只需要一点点样本，就可以反应得到很多很多的一模一样的核酸了！”小何恍然大悟。

“你说的没错，也正是因为核酸在数量上呈现指数增长，我们才可以通过荧光强度的增长来判断是否含有目的基因。

如果被检测的样本是含有病毒核酸的，每经历一次循环，被检测的目的基因就会扩增一倍，接入目的基因的荧光探针和释放的荧光源也会增加一倍，直到反应结束。当然，随着原料的消耗，反应也会趋于停止，所以目的基因的数量和荧光强度会呈现S型增长。那么如果检测到了荧光也就代表检测到了病毒基因，所以结果就称为阳性。

如果被检测的样本不含病毒核酸，那么在PCR反应过程中就没有目的基因被扩增，荧光探针也无法结合，其淬灭机制仍然存在，就不会检测到荧光。”小智进一步解释道。

“那我们检测的目的基因到底有哪些呀？”

“目前我们检测的主要是新冠病毒特殊的N基因和ORF (open reading frame) 1ab基因，引物和荧光探针也是根据这两个基因的序列设计的。中国最早发布的冠状病毒全基因组序列帮助科学家们迅速确认了两种目的基因。”

“精确的病毒遗传信息，巧妙的复制过程，可靠的荧光检测法，这些都保证了核酸检测的准确性，难怪我们称核酸检测为金标准！”

3 单采，混采和混检

过了几天，疫情形势依然严峻，按照学校要求，小何和小智参与了第二轮核酸筛查。

一样的网上预约，一样的排队。

每一次筛查的范围都是全民的，那么要采集的样本数量也是巨大的。如果对每一个样品都要单独进行扩增的话，那岂不是要很多很多的PCR仪器？小何一边排着队，一边思考着。

采样时，小何注意到了一个奇怪的现象：医护人员并没有单独存放每一个人采样的咽拭子，而是把多个咽拭子放在一个试管里。为什么这么做[1,2]？

“护士姐姐您好，请问为什么把不同人的咽拭子放在一个试管里呀？这样不会互相污染吗？”

“同学你好，这是因为我们采用的是混合采样呀。”

“混合采样？就是把好几个人的样品混合到一起吗？可是这样，结果的准确性还能保证吗？”小何坐不住了。

“你的怀疑是有道理的，我来给你解释吧。”小智一把拉过做完采样的小何。

“其实混合采样是充分权衡准确性和检测效率的结果，这其中蕴含着非常巧妙的数学原理。混合采样并不是把随意数量的样本放在一起拿去检测。”

“我们要检测的样本那么多，如果每个人都用一个试管收集样本，每个样本都需要单独检测，那得需要多少检测设备和时间啊！

你想一想，其实接受检测的大部分人都没有感染新冠病毒，所以大部分人的检测结果其实都是阴性。这就为混合采样提供了可能。”小智向小何解释道。

“哦！所以把多人的样品放在一起，如果这个试管的样品都没有检测出阳性，就可以说明这些人都是未感染的！毕竟在感染率较低的地区，即使样品混合在一起，最终的检测结果为阴性才是大概率事件！”小何恍然大悟。

“是这样的，用混采的方式采集样本，不仅节约了大量的试管，也节约了时间，尤其对于这样的大范围筛查。我们必须要考虑到效率和成本啊！此外，混合采样不仅方便了采样过程，也极大地方便了实验室的检测过程。”小智说道。

“可是如果发现阳性了呢？我们没法确定混合样品的提供者中，到底谁是感染者。”小何细细一想，又发现了问题。

“如果这个混采样品的反应结果是阳性，那么混合采样的这一组人都有可能是病毒感染者，所以必须再次单独地对这几个人进行检测，最后确定病毒的感染者。”

“那么确定混合的人数就显得非常重要！如果混合比例过高，极容易因为一个阳性就要让许多人都要再检测一次，反而浪费时间和原料。”小何发现了混采的关键。

“你说的没错，混合的比例和多个因素相关。简单来说，如果被检测的人群中感染率很高，那我们就应该适当降低混合比例；如果感染率不高，就可以提高混合的比例。事实上，我们有一套完整的数学模型来计算混合的比例。”小智详细地向小何解释道。

“全民的核酸筛查是大规模、大范围的检测，如何保证高效率同时尽可能节约人力物力检测，确实是一门学问啊！”小何感叹道。

4 抗原试剂盒

严峻的疫情形势下，小何的大学进行了封校封楼的疫情管控措施。聚集采样确实会带来不小的感染风险。那有没有不用核酸采样，一个人在隔离期间可以自行完成的检测方法呢？

学校为同学们提供了一种更加方便快速的检测方法——抗原试剂盒。

“小智，你觉得抗原试剂盒可以做到核酸检测那样准确吗？”小何看着手中的试剂盒问道。

“你知道，病毒是由外层的蛋白质外壳和内层的核酸遗传物质组成的，如果说核酸检测中检测的是病毒的内核，那么抗原检测就是检测病毒的外衣。

抗原自测的原理是抗原和抗体的结合。抗原和抗体就像是一个榫头一个卯。抗原是病毒的外衣，有特定的化学结构。抗原检测中，鼻拭子上会被放置一些专门的抗体，如果被检测的样本是带有病毒的，那病毒的抗原就会和拭子上的抗体结合，发生反应，从而被我们观察到。

但是，蛋白质没法像核酸那样通过PCR技术扩增，所以如果病毒量不大，抗原检测就很难准确检测。所以，抗原检测是肯定不能代替核酸检测的[2]！”

“但是抗原检测确实非常方便快捷，自己在家就可以完成测试，虽然不像核酸检测那么准确，但是也有它发挥用处的地方，比如我们这些封楼隔离的人，等待结果的时间也大大缩短了。”说着，小何和小智都笑了。

然而，抗原自测的准确性和个人操作的规范性是否达标有很大关系。倘若自测人员的操作不够规范，也会影响到采集到的样品和检测结果的准确性。

5 结语

总之，无论核酸检测还是抗原检测，都是利用现有方法检测新冠病毒的特异性成分。不同之处在于，检测核酸的过程中，我们可以利用生物化学的方法把采集到的少量样本，通过扩增反应得到大量副本，从而提高检测精度；而对于抗原自测，当病毒量较少以及自测操作不够准确规范时，其可靠性会大大下降。

新冠疫情来势汹汹，对于新冠病毒的检测我们目前有多种可行的方法，可以在不同的需求和情境下，各取所长。但是，核酸检测依然是新冠病毒检测的金标准。