基于高通量测序技术挖掘分子遗传标记及其在蛋鸡生产中的精准应用

赵金波，谭 磊，潘洪彬，黄 畅，刘 永，王光正，豆腾飞，王 坤，李子健，葛长荣

(1.云南农业大学动物科学技术学院，昆明 650201；2.黑龙江省农业科学院畜牧兽医分院，齐齐哈尔 161005)

中国地方畜禽品种资源丰富，畜禽遗传多样性的可持续利用是打好种业翻身仗，解决产业“卡脖子”核心技术的最主要育种素材，也是保障食物充足供应的先决条件。《全国畜禽遗传改良计划(2021—2035年)》远景规划着重指出“力争用10～15年的时间，建成比较完善的商业化育种体系，显著提升畜禽生产水平和品质水平，自主培育一批具有国际竞争力的突破性品种，确保国内畜禽品种核心种源自主可控”[1]，特别是在蛋鸡遗传改良计划中重点提出了基因组选择进入实质的应用阶段[2]。中国自2004年完成第一个红原鸡全基因组测序之后[3]，相继完成了牛[4]、山羊[5]、猪[6]、草鱼[7]、绵羊[8]等家养动物的参考基因组测序工作，在此基础上通过高通量测序技术的不断优化提升，一系列与生产密切相关的畜禽基因组变异被充分挖掘出来，进而在DNA分子水平上通过分子生物学手段进行分子标记，为加速现有畜禽品种改良和早期选种提供了强大的技术支撑。理想的基因组变异检测技术是在全基因组测序基础上进行的，基于高通量测序技术充分挖掘分子遗传标记，能够高效、精准的捕获生物体大量遗传变异，挖掘基因资源，促进物种的基础研究及其上下游产业的发展。将测序技术与常规育种方法相结合，能够挖掘大量可利用遗传变异，提高育种的遗传进展，从而为畜禽种业创新发展提供良好平台。

1 测序技术的发展历程及应用领域

1.1 测序技术的发展历程及应用平台比较分析

自2003年完成人类基因组计划后，基因组测序技术取得了长足的进步，这也使测序的成本大幅度下降[9]。在第一代Sanger测序技术的基础上，相继又发展起来了二代和三代测序，因二代测序技术具有通量高、成本低、读长短等特点[10]，又被称为高通量测序技术或下一代测序技术。测序技术经历3个阶段的发展过程：第一阶段以1977年Sanger和Walter Gilbert发明传统测序技术为开端[11]，第一台测序仪诞生标志着大规模的基因序列测定成为了可能，首个人类基因图谱的绘制就是以改进的Sanger测序技术为基础产生的，至今，Sanger技术仍然被广泛应用，但一次测序只能完成700～1 000 bp，无法满足现代科学技术对挖掘生物基因序列的迫切需求，因此高通量测序技术应运而生；第二阶段即第二代测序技术在第一代测序技术的基础上进行了革新性改造，一次运行测序就能完成几十万条至几百万条的核酸分子序列，其读长短、准确性低的缺点带来测序深度不深和拼接技术的准确性不够等问题；第三阶段针对第二代测序技术存在的上述问题，开发了第三代测序技术，又称为单分子实时DNA测序技术，该技术在保证通量的基础上，从单条长度从头测序，能够直接得到数百万个核酸的序列信息。从应用平台的比较分析来看，三代基因测序技术的应用平台在不断地提升测序能力，目前就市场形势来看，高通量测序技术仍在市场中占有绝对优势。第三代测序技术也在近几年的科学研究中快速发展。二代测序技术以罗氏454测序仪(Roche GS FLX Sequencer)、Illumina公司的Solexa基因组分析仪和ABI的SOLiD测序仪为主要的测序平台。三代测序技术以Pacific Bioscience的SMRT技术、The Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子测序技术为主要测序平台，解决了二代测序读长短、准确性低的问题。测序技术的应用平台的优劣势、测序原理以及应用领域总结如表1。

1.2 测序技术的应用领域

在高通量测序技术的基础上，通过对物种的个体或群体进行基因组测序或差异分析，从而获得大量的与生物表型密切相关的遗传变异，如单核苷酸多态性位点(SNP)[27]、小片段的插入和缺失(Indel)、结构变异(SV)、拷贝数变异(CNV)[28]以及转座子变异等，用于开发分子遗传标记，建立遗传多样性数据库，为物种的进化关系、挖掘功能基因、高效精准的早期选择以及辅助分子育种提供重要的数据支撑。以中心法则为核心的高通量测序技术也演变出很多分支测序技术，如不需要任何参考序列就能对某一物种进行基因组测序的Denovo技术，也称为从头测序[29]；对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序的全基因组重测序技术(WGS)[30]；在生物体整个基因组捕获转录因子或组蛋白修饰DNA靶点的全基因组甲基化测序技术(WGBS)等[31]。由于连锁不平衡的作用，利用全基因组关联分析(GWAS)分析的目标性状关联的序列区域具有较大的宽度，不能精准地逐渐聚焦而定位到目标性状的核心区域。研究表明，GWAS发现的SNP会影响到附近区域基因的表达量，最终造成锁定的目标区域不是与生物表型性状高度相关的区域[32]，因此，联合转录组学，从复杂的区域逐步锁定控制表型性状的关键基因，GWAS和转录组联合分析可以实现结果准确性的相互验证。一直以来，研究认为转录调控受RNA的直接影响，但随着鸡、鸭全基因组测序数据的公布，发现参与基因转录调控的编码蛋白约占全部序列的2%，其余98%是受非编码蛋白RNA调控[33]。因此，高通量测序技术也产生了转录组、全转录组、空间转录组以及单细胞转录组等新技术。随着转录组技术的不断优化提升，原本被认为是“转录噪音”的非编码序列越来越多被发现，以小RNA(microRNA)、长链非编码RNA(lncRNA)、环状RNA(circRNA)以及与PiWi蛋白互作的RNA(piRNA)为代表的非编码RNA在细胞分化、增殖、生长、凋亡等重要的生理过程中发挥着重要作用[34-36]。单一的组学技术在解释复杂性状的生物学现象方面往往缺乏系统性，对畜禽生长发育机理、重要经济性状功能基因的挖掘都不深入，多组学联合分析可分别从基因、mRNA、转录因子、调控因子、蛋白、代谢路径等不同层次上进行信息的整合，构建基因互作调控网络，解析复杂性状形成的分子机理和遗传基础[37]。高通量测序技术在基因组、转录组以及多组学联合分析方面的应用领域如图1所示。

图1 高通量测序技术应用领域Fig.1 Application fields of high-throughput sequencing technology

高通量测序技术是以中心法则为核心建立起来的技术体系，在中心法则中，DNA水平的基因组学处于最上游，决定了基因的基本属性，RNA水平的转录组学处于中央枢纽地位，但基因不能最终决定生物表型，它还受到表观遗传修饰、转录、翻译、转录后加工以及环境等因素的影响，并且这些影响和改变最终都体现在代谢物的差异上，代谢组学常被称作是基因组学和表型之间联系的纽带，也是能够用生物标记物解释复杂生物性状最直接的体现[38]。因此，多组学联合分析也是高通量测序技术的升级版，产生了“基因组+转录组”、“转录组+代谢组”、“转录组+表观组”以及“转录组+代谢组+蛋白质组”，这些组学之间既各自独立又相互关联，从不同的角度解析了生物性状形成的分子机理和遗传基础。

2 分子遗传标记检测技术在现代蛋鸡种业创新中的应用

随着高通量测序技术的不断更迭，海量的分子标记被挖掘，分子遗传标记挖掘的准确性取决于测序深度和组装拼接的准确性。通过高通量测序技术进行基因挖掘、定位、候选基因的筛选，并对候选目标基因区域SNP、Indel、CNV和SV等基因组变异进行结构注释和功能注释，同时，将分子遗传标记与常规育种手段结合，这样才能更好地为现代蛋鸡种业创新服务。目前，按照遗传标记检测技术发展的先后顺序，常见的分子遗传标记检测技术主要划分为3个阶段，以下针对分子遗传标记的3个阶段进行阐述。

2.1 第一代分子遗传标记

第一代分子遗传标记主要包括限制性片段长度多态性(RFLP)、随机引物扩增多态性(RAPD)和扩增片段长度多态性(AFLP)。RFLP是最早应用于群体遗传多样性分析的分子遗传标记[39]，利用限制性内切酶酶切DNA分子后形成特定大小的DNA片段，因其具有共显性的特点，可以通过电泳条带直接分析基因型，适合构建遗传图谱，同时其具有不受性别、年龄和生长阶段限制的优点，因而被广泛应用于群体多样性分析、功能基因数量性状基因座(QTL)多态位点挖掘、传染性疾病诊断等领域。曹顶国等[40]利用RFLP-PCR技术检测汶上芦花鸡、济宁百日鸡和莱芜黑鸡极低密度脂蛋白受体(VLDLR)基因的SNP,分析发现VLDLR基因的V8467和V13876的SNP可以作为蛋鸡蛋黄性状的分子标记；邵勇刚等[41]利用RFLP-PCR技术检测拜城油鸡公鸡的脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)基因多态性与生产性能相关性的研究发现，在拜城油鸡公鸡中共检测到3个A-FABP基因型，分别为AA、AB、BB型，其中BB型为优势基因型，BB型个体与脂肪性状相关的生产性能高于AA型个体，且不同年龄不同基因型之间存在差异，这也就进一步解释了A-FABP基因可以作为拜城油鸡公鸡的分子遗传标记用于育种；Parviz等[42]利用RFLP-PCR技术对影响蛋壳质量的蛋壳基质蛋白卵黄蛋白原-32(OCX-32)基因进行基因分型，SNP (c.193A>C)是一种错义突变(天冬酰胺取代组氨酸)，同时也解析了OCX-32基因能够中止钙化，与钙结合蛋白D28K作用相反，影响蛋壳中钙的沉积量，从而调控蛋壳颜色和蛋壳质量。为了克服RFLP技术上存在的多态位点低、技术复杂、成本高等缺点，RAPD在RFLP技术的基础上进行优化提升,渗透于基因研究的各个领域，主要原理是随机设计引物(8～10 bp)，通过PCR反应非定点扩增DNA片段，经过凝胶电泳、溴化乙锭染色，结果显示出扩增片段DNA多态性，该技术具有操作简单，设计的随机引物可以用于不同基因组分析，用1对引物就可以扩增出很多片段，具有不需要同位素、安全性好等优点，但也存在准确性和重复性差的缺点。AFLP是在RFLP和RAPD检测技术基础上发展而来的，具有RFLP高重复性和RAPD技术操作简单等双重优点，它将基因组DNA成对的经限制性内切酶酶切产生的片段用接头(与酶切位点互补)连接起来，并通过5′-端与接头互补的半特异性引物扩增得到大量DNA片段，从而形成指纹图谱的分子标记技术。目前，AFLP技术已经在畜禽遗传育种中发挥了它的优势。

2.2 第二代分子遗传标记

第二代分子遗传标记主要包括简单重复序列(SSR)和简单重复序列间区(ISSR)。在真核生物基因组中普遍存在许多非编码的重复序列，其大小只有1～6 bp，串联成簇的长度为50～100 bp，称为短串联重复序列(STR)，又称为简单重复序列(SSR)[43]，因其具有多态性(PIC)高、数量多且广泛分布在基因组中的特点，被广泛应用在个体及亲缘关系鉴定、构建遗传连锁图谱、杂交优势预测、群体遗传距离分析以及功能基因定位及QTL定位[44]。每个微卫星两侧一般都是相对保守的单拷贝序列，据此可以涉及专一性引物，通过PCR技术扩增微卫星片段，扩增产物经凝胶电泳分离后，不同个体间因核心序列的重复次数不同而产生DNA多态性。研究表明，随着SSR碱基的增加，条带会逐渐减少，多态性的区域就会变得更加明显，基因分型就越准确[45]。曲鲁江等[46]利用28对个微卫星检测中国地方品种大骨鸡和北京油鸡2个保种场保种效果比较分析，发现各个群体间均有较高的多态性，杂合度为0.55，各位点等位基因数目为2～22个，除LEI10194和MCW0032外，其余26个微卫星位点都处于基因平衡状态。伍革民等[47]利用7个微卫星标记对贵州省的4个乌骨鸡群体进行群体遗传结构和遗传距离的分析发现，4个乌骨鸡群体多态信息含量在0.6431～0.6913，杂合度在0.7069～0.7385，当PIC>0.5时，表现为高度多态，4个乌骨鸡群体平均杂合度越大，表明群体的遗传变异程度越高，群体遗传多样性越丰富。Hillel等[48]充分利用SSR技术对来自多个国家的52种鸡群的群体内和群体间遗传多样性进行了评估，发现商业品系的各个位点平均杂合度为0.29，平均群体内杂合度为0.47，而地方品种平均杂合度为0.50，说明在鸡群进化过程中地方品种内部由于遗传漂变等因素的影响，导致了群体遗传多样性要比商业品系高，为利用好地方品种遗传资源提供了新的路径和新的见解。ISSR技术是在SSR技术基础上建立起来的加锚核苷酸技术，ISSR技术应用于群体遗传多样性研究、亲属关系以及系统发育方面的研究。武玉珍等[49]利用ISSR技术对褐马鸡两大种群各35只鸡进行亲缘关系分析发现，个体遗传相似性的平均值为0.5061和0.7591，遗传距离平均为0.4939和0.2409,表明在相同生态地理条件下种群的亲缘关系较近。ISSR解决了SSR技术在物种间引物设计费时费力的缺点，无需预先克隆和测序，节约减少了试验前期的准备工作的强度[50]。

2.3 第三代分子遗传标记

第三代分子遗传标记主要包括SNP和表达序列标签(EST)。SNP是DNA上单个核苷酸变异导致DNA序列多态性，大约1 000 bp存在1个SNP，SNP检测技术是第三代遗传分子标记中最具应用价值的分子标记技术[51]，常见的有碱基的转换、颠换、缺失或替换导致的DNA序列多态性[27]。SNP分子标记因其密度高、遍布基因组、易于实现自动化等优点被广泛应用[52]，但仅因1个位点的SNP变异很难影响到基因的表达和编码蛋白序列，进而影响到表型的差异。2014年Carneiro等[53]在研究家兔驯化遗传机制方面发现，通过全基因组测序技术共发现5 000万个SNPs，但真正能影响到氨基酸编码的错义突变只有7万个SNPs，在驯化过程中保留下来的错义突变只有14个SNPs，说明SNP分子标记技术也有其局限性。对于挖掘SNP主要取决于采用的SNP研究策略，目前主要采用低通量的实时荧光定量PCR和高通量测序技术制备SNP芯片来挖掘SNP。针对SNP具有数量大且只有一小部分属于关键功能变异的特点，SNP的研究和应用进入了瓶颈阶段，目前，CNV成为了继SNP之后的关注热点，主要是因为CNV属于大片段结构变异，覆盖较大区域的基因组序列，甚至能够影响基因序列的表达[54]，一些重要的CNV已经在人[55]、牛[56]、羊[57]、猪[58]、鸡[59]等上被挖掘，并表现出与一些数量性状和质量性状形成的遗传机制高度相关，可以作为一种继SNP分子标记之后的另一个理想的分子遗传标记，用于畜禽育种。EST是指来源不同的组织的cDNA文库，随机挑选克隆、测序得到的cDNA序列，EST可以代表生物体某种组织某一时间的1个表达基因，目前来看，EST标记技术广泛应用于植物基因组研究，关于应用EST标记技术在动物基因组研究中鲜见报道。

3 高通量测序技术在蛋鸡生产中的精准应用

3.1 群体遗传多样性及进化分类

利用分子遗传标记在评价群体遗传多样性方面，很多研究都集中在运用杂合度(He)、纯合度(Ho)、有效等位基因数(Ne)以及PIC等指标来评价。在评价群体进化方面，尤桂爽等[60]利用简化基因组GBS测序方法对四川盆地6个鸡群遗传关系进行了研究，利用He、PIC以及核酸多态性(Pi)等指标评价了6个鸡群的遗传多样性，岩水鸡黑羽群体的遗传多样性较低(He=0.154，PIC=0.125)，大宁河鸡遗传多样性最为丰富(He=0.197,PIC=0.162)为低多态性，杂合度和多态信息含量是衡量群体标记多态性的重要指标[61]，四川盆地的6个地方鸡的He范围在0.154～0.197,这也和Cendron等[62]研究意大利6种地方鸡的研究结果一致。韩威等[63]利用简化基因组测序技术(RAD-Seq)对19个地方鸡种进行基因组SNP标记，在19个鸡种中共鉴定出400 562个SNPs，进一步证实了中国地方品种遗传多样性丰富，利用He、Pi、近交系数(Fis)、遗传分化系数(Fst)基因流(Nm)评价了19种地方鸡的遗传多样性和遗传分化情况，瓢鸡和文昌鸡的遗传多样性最为丰富,Ho分别为0.2468、0.2430,Pi分别为0.2781、0.2655;河南斗鸡的遗传多样性相对匮乏,Ho为0.1560,Pi为0.1752;东乡绿壳蛋鸡和边鸡的近交系数最高(Fis>0.1600)。瓢鸡与文昌鸡、惠阳胡须鸡、藏鸡、大围山微型鸡,惠阳胡须鸡与文昌鸡,藏鸡与茶花鸡间的遗传分化最低(Fst<0.1000),对应的基因流最高(Nm>0.2400)，为中国地方鸡品种资源保护、开发及利用提供了技术支撑。

3.2 群体遗传图谱的构建和功能基因定位

利用高通量测序技术挖掘分子标记，很难定位到目标性状的候选区域，因此对分子遗传标记的选择显得十分重要。遗传图谱能够缩小分子标记的数量，可以根据专一分子标记或基因在染色体上的相对位置排列而成，遗传图谱是全基因组关联分析成功的一个重要的前提。在鸡的NCBI SNP数据库中有超过900万个SNPs标记[64]，鸡的遗传图谱的相对长度为3 800 cM,在鸡的基因组中由10亿个碱基组成[3]，大约200 bp存在1个SNP突变位点[65]。吴丹等[66]对北京油鸡的生长性状进行关联分析，利用鸡的60K SNP芯片对其28、56、80和100日龄的体重进行GWAS，发现影响北京油鸡体质量性状的全基因组关联位点为9个，潜在关联位点为96个，找到了LIM结构域结合基因(LDB2)、LYR基序含子基因(LYRM1)、配体依赖性核受体辅阻遏物样基因(LCORL)等候选基因，这些候选基因和分子标记为北京油鸡种质资源的评价、利用及保护提供了育种素材。孙艳发等[67]利用60K SNP芯片对鸡的体重、胫长和胫围进行全基因组关联分析，达到5%显著性全基因组关联位点分别有1和4个，潜在关联位点分别为4和25个，分布在4号染色体14.93 Mb区域的SNP位点与胫长和胫围有着显著或潜在的联系，这个区域内含有LIM结构域结合因子2(LDB2)、细胞分裂染色体双轴取向1-样1(BOD1L1)以及醌式二氢蝶啶还原酶(QDPR)等候选基因，8号染色体上有1个SNP位点位于ELA样蛋白4(ELAVL4)基因下游的52 248 bp处，13号染色体上有1个SNP位点位于同源异型盒蛋白Nkx-2.5(NKX2.5)基因下游的138 834 bp处，这些候选位点都为解析胫长和胫围的遗传机制提供了新思路。Julien等[68]利用全基因组测序技术解析了日本鹌鹑的社会行为、侵略性等指标，利用2 145个分子标记构建了其遗传图谱，其中1 479个标记可定位在不同的28个连锁群上，平均遗传连锁图谱长度为3 057 cM，平均标记距离为2.1 cM，在QTL定位结果中发现45个QTLs，其中22个与行为有关，23个生产性能相关，这些QTL定位区域的发现也为优化动物福利模式提供了遗传机制上的新见解。因此在蛋鸡生产中应用分子标记进行分子育种、构建遗传图谱、定位功能基因，有助于加快新品种育成速度和解决蛋鸡产业“卡脖子”关键技术。

3.3 数量性状形成的遗传机制解析

吴常信等[69]在基于国外育种公司提出的“100周产500枚蛋”计划是否能实现，进行了可行性的分析，虽然这种设想在2020年实现“100～500”计划是不可能的，但也对中国蛋鸡产业具有很强的借鉴意义，确定了“提高80～100周龄的产蛋率”和“增强产蛋后期蛋品质选择”是中国蛋鸡育种的目标。在这2个育种目标的指引下，很多研究人员都进行了有益的探索。在增强蛋品质方面，现在大多采用全基因组关联性分析和分子标记辅助选择技术进行了大量的研究，对鸡的初生重以及48和60周龄的产蛋量和蛋黄颜色，使用全基因组关联性分析，获得了26个与蛋品质显著相关的SNP位点[70]；用高密度阵列的全基因组关联研究对东乡蓝壳鸡与白来航鸡杂交产生的F2代资源群中获得的禽蛋，通过双性状动物模型和基因注释获得了蛋壳的候选基因，分别是调节突触膜胞吐2(RIMS2)、溶质载体家族(SLC25A32)、液泡分选蛋白13B(VPS13B)和G蛋白信号调节器3(RGS3)[71]；结合分子标记辅助选择技术，为同时表现蓝蛋壳和矮化性状的纯种鸡提供了一种快速育种方法[72]。目前在蛋品质研究中所产生的候选基因、大量的QTL和致病基因，但由于分子标记的遗传效应过小，所能解释表型差异的生物学现象有限，分子辅助标记选择至今没有一个完整的、成功的育种方案，导致这些成果在商业品系中并不能得以应用[73]。因此，在后续的研究中着重于对候选基因重要功能SNP位点的挖掘，以及调控这些功能基因的上下游信号通路的生物学机制的研究应用到蛋鸡品系培育中，更好地为家禽的早期选育以及重要经济性状应用奠定基础。在提高产蛋率方面，家禽产蛋受环境、内分泌、遗传因素的共同调节。随着分子遗传学技术和DNA分子标记的出现，家禽产蛋性能相关性状的QTL用于分子标记辅助选择的研究迅速发展[74]，现多使用高通量测序，利用分子育种策略，可以使家禽养殖行业最大限度地降低生产成本。采用RNA-Seq测序技术，对芦花鸡下丘脑、垂体和卵巢组织进行了转录组分析，从15个文库中产生了76.09 Gb的RNA-Seq序列，每个文库的平均大小为5.07 Gb[75]；Liu等[76]使用线性混合模型对1 078只洛岛红鸡进行了全基因组关联研究筛选出大量的候选基因，但并没有发现任何影响总蛋数的候选基因。Wu等[77]对抗缪勒管激素(AMH)外显子设计引物并扩增，发现京海黄鸡AMH基因第二外显子的多态性及其与繁殖性状之间的关系，并检测出4个SNP位点为家禽育种提供了分子标记区段；Wolc等[78]通过使用品系特异性50K Affymetrix Axiom SNP芯片进行全基因组关联分析，发现了参与卵母细胞成熟的Wiskott-Aldrich综合征蛋白和富含脯氨酸同源物(WASH1)、调节卵泡刺激素分泌的神经肽VF前体(NPVF)及参与卵泡的卵母细胞成熟和排卵的叉形头转录因子3(FOXO3)；Rowland等[79]使用SNP芯片进行GWAS关联分析发现，3个候选基因膜泡蛋白分拣36(VPS36)、雄激素受体(AR)和无翅型小鼠乳房肿瘤病毒整合位点家族(WNT11B)在卵泡发育、性腺生长和真皮发育方面起重要作用；Azmal等[80]发现，京红鸡3号和13号染色体上的12个SNPs与产蛋后期受精率显著相关。因此，利用高通量测序技术挖掘与产蛋性状相关基因的SNP变异位点，并对其进行分子标记，能够在蛋鸡生产中进行高效选种，提高选种强度，进而实现较快的遗传进展。

3.4 质量性状形成的遗传机制解析

针对冠型、羽色、蛋壳颜色、矮脚等具有代表性的性状，运用高通量测序技术解析蛋鸡的质量性状形成的遗传机制，能够在蛋鸡早期根据羽速或羽毛特征来鉴别雌雄、进行高效选种，减少饲养成本给育种带来的经济负担。控制质量性状的等位基因有不完全显性和完全显性的现象，对于不完全显性的性状，能从表型中直接分辨基因型，根据表型选择也就是基因型选择从而达到高效选种的目的。有研究利用全基因组测序技术对东乡鸡、卢氏蛋鸡和绿壳蛋鸡Araucana进行测序，发现了有机阴离子转运家族成员(SLCO1B3)基因上游启动子区域中部分内源逆转录病毒(EAV-HP)的插入导致鸡绿壳蛋的形成有关，是由于逆转录病毒片段会导致相邻基因的异位表达或异常表达，从而影响SLCO1B3基因的表达[81-83]。Feng等[84]利用全基因组测序技术揭示了鸡丝羽性状是由癸二烯二磷酸酶亚基2(PDSS2)顺式作用调控引起，并对根据该位点建立了丝羽性状的分子标记用于指导生产。Wright等[85]利用高通量测序技术揭开了鸡豆冠形成是由于SRY转录因子5(SOX5)基因的一段非编码序列拷贝数增加而引起，鸡冠性状对于高效选种也十分重要。Cui等[72]利用分子辅助标记选择策略，对绿壳蛋和矮脚2个性状进行选择，培育出绿蛋壳矮脚性状的纯种鸡品系，就是应用SLCO1B3和生长激素受体(GHR)基因的分子标记技术培育而来。Luo等[86]利用组织切片、全基因组关联研究和RNA-Seq技术，进一步研究了羌源麻鸡红/白耳垂形成的组织学和分子遗传学机制，这些利用质量性状快速培育鸡的新品系的新方法和新视野，为利用蛋鸡基因组高效选种进入实质阶段提供了技术支撑。

4 小 结

随着测序技术的不断更新换代，以新一代测序技术为基础发展起来的高通量测序技术和单分子实时测序技术都为挖掘基因变异做出了重要贡献。其中，高通量测序技术是现如今研究物种遗传变异形成机制的应用最为广泛的测序技术，高通量测序技术及分子遗传标记检测技术在蛋鸡生产中的精准应用主要有4个方面：①利用高通量测序技术能够挖掘与蛋鸡产蛋性能表型性状高度相关的基因组变异，并对这些变异进行检测，精准定位与产蛋性状相关的候选区域，形成分子遗传标记，利用基因组选择的遗传变异信息对蛋鸡群体或个体的遗传基础进行评定，从而达到缩短世代间隔，提高选种的准确性，实现较大的遗传进展；②在进行分子遗传标记筛选和功能验证过程中，利用多组学技术缩小定位产蛋性状候选性状区域范围，更加精准的挖掘产蛋性状的功能基因；③利用多种技术反复验证目标性状的候选基因，从而多维度的解析生物性状形成的机制，为蛋鸡基因组选择进入实质阶段提供技术参考具有重要指导意义；④利用分子遗传标记技术进行基因分型，选取样本进行PCR扩增产物测序，而后分析各个基因型对产蛋性状的遗传效应，本质上分子遗传标记检测技术是高通量测序技术的补充。目前应用高通量测序技术和分子遗传标记检测技术已经成功将控制绿壳性状的SLCO1B3基因应用于绿壳蛋鸡的品种培育上，将矮小基因应用于节粮型蛋鸡的培育上，因此，该技术助推了蛋鸡产业高质量发展。高通量测序挖掘分子遗传标记及其在蛋鸡生产中精准应用如图2所示。

虽然新一代测序技术在挖掘蛋鸡基因组变异上有诸多优势，但也存在着定位功能主效基因不准确、实际应用存在着诸多问题，因此，未来测序技术在蛋鸡生产中的精准应用，一方面要围绕开发中等密度SNP芯片用于分析鸡的重要经济性状和利用地方鸡资源培育新的蛋鸡新品系，解决中国蛋鸡品种“卡脖子”关键问题，另一方面用围绕运用多种新兴技术诸如染色质可及性分析(ATAC)、高通量染色体构象捕获技术(Hi-C)、单细胞测序技术等，更深层次解释表型差异的生物学现象，为解析蛋鸡重要经济性状形成机理提供技术支撑。