太行鸡CCNB2基因剪接异构体的克隆鉴定及其在卵泡发育中的表达模式分析

2022-10-20魏佳荣张贝贝马腾壑李梦霄李雪男付冠华王红娜

中国畜牧兽医 2022年10期

魏佳荣，张贝贝，马腾壑，2，李梦霄，李雪男，王斌，付冠华，王红娜，刘超

(1.河北工程大学生命科学与食品工程学院，邯郸 056038；2.河北工程大学医学院，邯郸 056038；3.河北天凯食品有限责任公司，邢台 054100)

B型细胞周期蛋白(cyclin B,CCNB)是细胞周期蛋白家族成员之一，主要分布于细胞质内，CCNB在细胞分裂进程中发挥重要的信号转导作用[1]。到目前为止，在家禽上总共发现了3种CCNB，即CCNB1、CCNB2和CCNB3，分别由CCNB1、CCNB2和CCNB3基因编码[2-3]。研究证明，CCNB在细胞中的积累与降解会影响细胞周期激酶(cyclin-dependent kinases，CDK1)的激活与失活，从而影响卵母细胞的减数分裂恢复[4-5]。CCNB作为CDK1激活的重要结合因子，可缓解由于DNA损伤导致的G2/M阻滞，从而恢复CDK1部分功能，减少因细胞缺陷引起的病变[6]。CCNB2调控细胞的增殖和分化[7-8]。Wu等[9]研究结果显示，CCNB2在G1期合成，随后表达量骤降，其缺陷会使G2/M检查点失效进而导致细胞的剧烈增殖。Luo等[10]在小鼠上的试验证明，CCNB2在卵母细胞分裂前期表达量上升，到后期急速下降，推测CCNB2基因表达量的差异会影响卵母细胞的正常增殖。张璐莹[11]在黄当归醇抑制肿瘤细胞增殖试验中检测到CCNB2基因的表达出现显著上升，使得细胞的增殖与迁移加快。总之，CCNB2是细胞分裂增殖过程中的一个细胞周期调节因子，是G2/M过渡时的一个催化要素[12]。已有研究表明，CCNB2基因对家畜卵母细胞的成熟具有关键作用[13-14]，但其在家禽上的表达规律及其在卵泡成熟过程的功能鲜见报道。

选择性剪接(alternative splicing,AS)是通过不同的剪接方法和剪接位点从单个前体mRNA产生不同成熟mRNA剪接异构体的过程[15]。AS事件通常被分为五大类：外显子跳过、5′-端可变剪接、3′-端可变剪接、互斥外显子和内含子保留[16]，Pandey等[17]研究了12种不同的后生动物基因组中不同类型剪接体事件的程度，结果表明外显子跳过事件在脊椎动物中更普遍，而内含子保留事件在无脊椎动物中更丰富。细胞周期蛋白表达过程中广泛存在选择性剪接现象，本研究以河北省地方鸡品种太行鸡为试验动物，克隆鉴定分析CCNB2基因不同剪接异构体，研究其在鸡卵泡不同发育时期中的表达模式，为进一步探讨该基因不同剪接异构体的功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物太行鸡来自河北天凯食品有限责任公司太行鸡育种基地。取5只饲养条件相同、体重相近的43周龄健康太行鸡母鸡，颈静脉放血处死，打开腹腔，立即取出卵巢，取不同发育时期卵泡，包括小白卵泡(small white follicle,SWF)、大白卵泡(large white follicle,LWF)、小黄卵泡(small yellow follicle,SYF)、大黄卵泡(large yellow follicle,LYF)以及F6～F1等级卵泡。液氮快速冻存，于-80 ℃保存备用。

1.1.2 主要试剂及仪器 EASY spin Plus RNA提取试剂盒购自北京艾德莱生物科技有限公司；HiFi Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit、荧光定量PCR试剂盒和常规PCR试剂均购自江苏诺唯赞生物科技股份有限公司；大肠杆菌DH5α感受态细胞购自生工生物工程(上海)股份有限公司；pMD19-T载体购自宝生物工程(大连)有限公司。

实时荧光定量PCR仪购自德国耶拿分析仪器股份公司；普通PCR仪购自上海研福生物科技中心；高速离心机购自上海卢湘仪离心机仪器有限公司；超低温冰箱、低温冰箱均购自青岛海尔生物医疗股份有限公司；恒温培养箱购自上海智城分析仪器制造有限公司；电子天平购自奥豪斯(常州)有限公司；高温鼓风干燥箱购自上海蓝豹试验设备有限公司；小型振荡器购自北京铭成基业科技有限公司。

1.2 引物设计与合成

根据原鸡CCNB2基因序列(GenBank登录号：XM_015278893.2和XM_015278892.2)，利用Primer Premier 5.0软件按照图1设计CCNB2基因剪接异构体鉴定引物，引物序列为：CCNB2-F：5′-AAGATGAAAAGCAGTGGGA-3′；CCNB2-R：5′ -AAGACAGAGGACAGGGATAC-3′。引物由苏州金唯智股份有限公司合成。

图1 CCNB2剪接异构体鉴定模式图Fig.1 Schematic diagram of CCNB2 splice isoforms identification

1.3 太行鸡CCNB2基因剪接异构体克隆鉴定

按照EASY spin Plus RNA快速提取试剂盒说明提取太行鸡小黄卵泡总RNA。利用HiFi Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit合成cDNA第一链，利用特异性PCR引物扩增CCNB2基因。PCR反应体系20 μL：2×TaqPlus MasterMix Ⅱ 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应程序：94 ℃预变性2 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸30 s，共33个循环；72 ℃再延伸2 min。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，连接至pMD19-T载体，连接体系为Solution Ⅰ 2 μL，pMD19-T载体1 μL，目的片段2 μL。在常温条件下连接10 h，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，并在含有氨苄的LB固体培养基上37 ℃培养24 h，挑取单克隆后，在含有氨苄的LB液体培养基中继续培养，经菌液PCR鉴定后送金唯智生物科技有限公司测序。

1.4 相似性比对及系统进化树构建

利用Seqman Edit软件拼接CCNB2基因完整开放阅读框(ORF)。利用DNAMAN软件对3种剪接异构体核苷酸序列进行比对，利用Mega 6.0软件进行不同剪接异构体氨基酸序列的相似性分析并构建系统进化树。原鸡(登录号：XP_015134378.3)、艾草榛鸡(登录号：XP_042680513.1)、雉鸡(登录号：XP_031472340.1)、红松鸡(登录号：XP_042731524.1)、吐绶鸡(登录号：XP_003209452.1)、鹌鹑(登录号：XP_015727897.1)、盗珠鸡(登录号：XP_021263444.1)、红鸭(登录号：XP_035192130.1)、雀鹅(登录号：NXI68343.1)、鬃林鸭(登录号：XP_ NXK48899.1)、云斑林鹑(登录号：NXJ11666.1)、猪(登录号：NP_001107754.1)、牛(登录号：NP_776689.2)、马(登录号：XP_023472342.1)、羊(登录号：XP_004010609.1)和小鼠(登录号：CAJ18494.1)CCNB2基因氨基酸序列来源于GenBank数据库。

1.5 不同剪接异构体的亚细胞定位及二级结构预测

1.5.1CCNB2基因剪接异构体蛋白的亚细胞定位预测利用在线服务器PSORT WWW Server中的PSORTⅡ Prediction(http:∥psort.hgc.jp/form.html)程序进行CCNB2基因不同剪接异构体蛋白的亚细胞定位预测。

1.5.2CCNB2蛋白二级结构预测利用在线软件NPS@:Network Protein Sequence Analysis(https:∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)对太行鸡CCNB2基因不同剪接异构体的蛋白二级结构进行预测分析。

1.6 太行鸡CCNB2基因剪接异构体在卵巢和不同发育时期卵泡的表达规律

利用实时荧光定量PCR检测3种剪接异构体在卵巢和不同发育时期卵泡(SWF、LWF、SYF、LYF以及F6～F1等级卵泡)中的相对表达量。采用Primer Premier 5.0软件根据鸡CCNB2基因序列(GenBank登录号:XM_015278893.2)设计太行鸡CCNB2基因实时荧光定量PCR引物序列，以GAPDH基因作为内参(表1)，引物均由苏州金唯智股份有限公司合成。按照EASY spin Plus RNA快速提取试剂盒说明提取太行鸡各组织总RNA，利用HiFi Script gDNA Removal cDNA Synthesis Kit将不同组织的总RNA进行反转录，合成cDNA第一链。PCR反应体系20 μL：2×TaqPlus MasterMix Ⅱ 10 μL，cDNA模板1 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应程序：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；熔解曲线：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。每个样品3个重复。利用2-△△Ct法来计算基因相对表达量，以卵巢组织中的表达量为对照。

表1 太行鸡CCNB2基因实时荧光定量PCR引物信息Table 1 Real-time quantitative PCR primer information of CCNB2 gene in Taihang chickens

1.7 数据统计分析

用SPSS 20.0软件中的单因素方差分析模型进行数据分析，Duncan氏法进行组间差异显著性分析，P<0.05作为差异显著性判断标准。

2 结果

2.1 太行鸡CCNB2基因克隆

太行鸡CCNB2基因剪接异构体PCR鉴定结果见图2A，条带大小约为247 bp。将扩增产物连接pMD19-T载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，菌液PCR结果如图2B所示，其中2、4和6泳道的样品经菌液测序，发现为CCNB2基因的3种剪接异构体，经序列拼接后，分别命名为CCNB2-AS1，CCNB2-AS2和CCNB2-AS3，长度分别为1 173、1 152和1 206 bp，分别编码390、383和401个氨基酸。核酸序列比对分析结果表明，3种剪接异构体核酸序列相似，差异序列主要位于序列前端(图3)。

M，DL2000 DNA Marker；1，CCNB2基因剪接异构体PCR扩增产物；2、4和6，菌液PCR产物；3、5、7、8和9，空质粒 M，DL2000 DNA Marker；1，PCR amplification products of CCNB2 gene splice isoforms；2，4 and 6，PCR products of bacterial solution；3,5,7,8 and 9，Empty plasmids图2 太行鸡CCNB2基因剪接异构体(A)和菌液(B)PCR扩增结果Fig.2 PCR amplification results of CCNB2 gene splice isoforms (A) and bacterial fluid (B) in Taihang chickens

图3 太行鸡CCNB2基因3种剪接异构体的部分核苷酸序列比对Fig.3 Partial nucleotide sequence alignment of 3 splice isoforms of CCNB2 gene in Taihang chickens

2.2 不同物种CCNB2基因的氨基酸序列相似性比对

太行鸡CCNB2-AS1、CCNB2-AS2和CCNB2-AS3 3个剪接体之间的氨基酸序列相似性均为97.00%，这3个剪接体均与原鸡的相似性最高，分别为99.71%、99.71%和100%(表2)。系统进化树结果显示，3种剪接异构体在进化上与原鸡亲缘关系最近，其次为雉鸡(图4)，与相似性分析结果一致。

表2 不同物种间CCNB2基因氨基酸序列相似性分析Table 2 Similarity analysis of amino acid sequence of CCNB2 gene among different species %

图4 太行鸡CCNB2基因3种剪接异构体氨基酸序列系统进化树Fig.4 Phylogenetic tree of amino acid sequences of 3 splice isoforms of CCNB2 gene in Taihang chickens

2.3 生物信息学分析

2.3.1 太行鸡CCNB2基因剪接异构体蛋白的亚细胞定位预测太行鸡CCNB2-AS1蛋白主要定位于细胞质(52.2%)，其他定位于细胞核(26.1%)、细胞骨架(13.0%)、液泡(4.3%)和线粒体(4.3%)。CCNB2-AS2蛋白主要定位于细胞质(52.2%)，其他定位于线粒体(17.4%)、细胞核(8.7%)、液泡(4.3%)、细胞骨架(4.3%)、内质网(4.3%)和细胞外(8.7%)。CCNB2-AS3蛋白主要定位于细胞质(52.2%)，其他定位于细胞核(26.1%)、线粒体(17.4%)、液泡(4.3%)和细胞外(4.3%)。

2.3.2 太行鸡CCNB2蛋白二级结构预测太行鸡CCNB2-AS1蛋白二级结构中，217个氨基酸参与α-螺旋，占比为55.64%；13个氨基酸参与氨基酸残基构成的延伸链，占比为3.33%；155个氨基酸参与无规则卷曲；占比为39.74%(图5A)。CCNB2-AS2蛋白二级结构中，220个氨基酸参与α-螺旋，占比为57.44%；20个氨基酸参与氨基酸残基构成的延伸链，占比为5.22%；136个氨基酸参与无规则卷曲，占比35.51%(图5B)。CCNB2-AS3蛋白二级结构中，237个氨基酸参与α-螺旋，占比为59.10%；15个氨基酸参与氨基酸构成的延伸链，占比为3.74%；142个氨基酸参与无规则卷曲，占比为35.41%(图5C)。3种剪接异构体的二级结构均以α-螺旋为主。

最长线，α-螺旋；次长线，延伸链；短线，无规则卷曲 Longest line,Alpha helix;Secondary long line,Extended chain；Short line,Random coil图5 太行鸡CCNB2-AS1(A)、CCNB2-AS2(B)和CCNB2-AS3(C)蛋白二级结构预测Fig.5 Secondary structure prediction of CCNB2-AS1 (A),CCNB2-AS2 (B) and CCNB2-AS3 (C) proteins in Taihang chickens

2.4 太行鸡CCNB2基因3种剪接异构体在卵巢和不同发育时期卵泡的表达规律

CCNB2-AS1在F6时期卵泡中的表达量显著高于其他时期(P<0.05)，从F5开始，表达量显著下降，且F5～F1的表达量无显著差异(P>0.05)，除了大黄卵泡，其他等级前卵泡中的表达量显著高于卵巢以及F6以外的等级卵泡(图6A)；CCNB2-AS2在大白卵泡中的表达量显著高于其他时期(P<0.05)，且从小黄卵泡开始，随着卵泡发育始终以较低水平表达(图6B)；CCNB2-AS3在F6～F4时期卵泡中的表达量显著高于其他时期(P<0.05，图6C)。

3 讨论

选择性剪接现象在家禽生长发育过程中广泛存在，有报道称约有30%基因存在剪接异构体[18]。虽然目前为止已发现的编码细胞周期蛋白的基因只有15种，但是由于剪接异构体的存在使得机体内蛋白质的种类增加数倍，约50种的细胞周期蛋白在机体内发挥作用，参与机体细胞的DNA复制[19-20]。目前关于CCNB2基因在人上研究较多，一般将其作为肝癌的预后标志物[21]。CCNB2基因作为肿瘤转移恶化的关键因子，调控肺癌细胞周期和转移[22]，诱导胶质瘤细胞衰老[23]，并可调控乳腺癌细胞增殖，这些功能的发挥都与其细胞周期调节功能有关。在家畜上，牛CCNB2基因可参与体外培养的卵母细胞成熟过程[24]。而在家禽中其是否参与调控卵泡发育的研究鲜见报道。本研究在太行鸡(国家畜禽遗传资源委员会审定的河北省第一个地方家禽品种)小黄卵泡中克隆鉴定到CCNB2基因的3种剪接异构体，长度分别为1 173、1 152和1 206 bp，分别编码390、383和401个氨基酸，ORF的5′-端1 035个核苷酸、345个氨基酸是一致的，说明其功能的差异可能由ORF起始序列引起的。

通过氨基酸序列相似性比对分析发现,相较于鹅和鸭，不同品种鸡中CCNB2的相似性较高，但是也存在一定差异，说明该基因在鸡中功能保守，可能发挥相似功能，而且该基因与其他物种相似性较低，说明不同物种可能发挥不同功能，具体CCNB2在鸡中发挥的功能还有待进一步探究。在牛上细胞周期蛋白发挥功能的主要位置在细胞质[25]，这与本研究结果一致，本试验对3种剪接异构体亚细胞定位预测结果显示其同样主要定位于细胞质中。蛋白质功能的发挥与其在细胞中的位置密切相关，因此，对蛋白质二级结构预测结果显示，3种剪接异构体的主要折叠方式为α-螺旋。

由于卵泡选择是影响鸡生殖力的重要因素[26]。本研究发现3种剪接异构体在不同时期卵泡中呈不同的表达模式，整体而言CCNB2-AS1在等级前卵泡中表达水平高于等级卵泡，CCNB2-AS2则在白卵泡中表达水平高于其他时期，而CCNB2-AS3表达模式则与CCNB2-AS1相反，值得注意的是，在卵泡选择的关键时期，即小黄卵泡向大黄卵泡发育过程中CCNB2-AS2表达并无显著差异，可能CCNB2-AS2并不参与卵泡选择而是参与调控其他功能。卵泡之所以在整个性成熟期能够发育，主要是通过卵泡颗粒细胞的调控[27-28]，CCNB2-AS3与CCNB2-AS1相反的表达情况，推测可能作为2种不同的调控因子在不同时期卵泡中发挥作用。前人研究显示鸡卵泡颗粒细胞膜上有大量促卵泡素受体(FSHR)，在等级前卵泡中伴随着FSHR高表达的同时，CCNB2基因表达量上升，在排卵后期表达水平则较低[29-30]，与本研究中CCNB2-AS1 mRNA表达结果相似。另外，3种剪接异构体在卵泡选择前后的SYF卵泡与LYF卵泡中的表达情况并不一致，具体功能仍需要进一步深入研究。