五爪金龙抑制香蕉枯萎病有效成分的鉴定与抑菌效果分析

顾承真，高钰杰，邱子宿，吕 晶，李 婷，曾任森

(1.福建农林大学生命科学学院， 福建 福州 350002； 2.福建农林大学作物科学学院作物抗性与化学生态学研究所， 福建 福州 350002)

香蕉枯萎病Fusarium wilt of banana主要是由尖孢镰刀菌古巴专化型Fusariumoxysporumf.sp.cubenseFOC引起的维管束病害，严重制约香蕉产业的发展，其具有分布广、发病快的特点，每年给香蕉产业造成巨大的经济损失，也称为香蕉的癌症[1]。目前，主要通过化学防控[2]、轮作其他作物[3]、农艺措施防控[4]和生物防控措施等[5]来应对香蕉枯萎病的发生和危害。化学农药防治效果比较直接、高效，易造成环境污染、农药残留、食品安全和病原菌抗药性增加等问题[6]；轮作会降低香蕉的经济收入[7]；通过香蕉-水稻轮作联合添加有机肥料的农艺措施[4]起不到很好的防治效果；生物防控大多采用生物有机肥料和菌剂来抑制病原菌，虽然不会带来环境问题，但其效果并不稳定[8]。目前，香蕉枯萎病还没有较好的防治方法。

植物是生物活性化合物的天然宝库，植物源农药的有效成分是植物的次生代谢产物，如生物碱类、黄酮类、萜类和酚类等。植物源农药具有易降解、不会造成环境污染、靶标有害生物不易产生抗药性、对非靶标生物安全、防治农作物病害效果稳定等特点[9]。五爪金龙IpomoeacairicaLinn.Sweet为旋花科Convolvulaceae番薯属 Ipomoea多年生藤本植物，主要分布在热带地区，在我国主要分布在南部，是外来入侵物种之一[10]。五爪金龙在生长过程中能够产生大量的次生代谢产物，比如黄酮[11]、木脂素[12]、香豆素[12]、脂肪酸[13]、挥发油[14-15]等。这些次生代谢产物不仅具有十分重要的研究和应用价值，还是五爪金龙入侵的武器。五爪金龙叶片水提取液可以使薇甘菊Mikaniamicrantha的叶绿素含量降低，从而抑制光合作用，并且对种子的萌发及根的生长具有明显的抑制效应[16]。五爪金龙乙醇提取物对柑橘潜叶蛾Phyllocnistiscitrella的产卵具有驱避作用[17]，对于福寿螺Pomaceacanaliculata具有致死作用[18]。此外，五爪金龙提取物还具有体外抗肿瘤活性[19]，其中含有的异绿原酸具有镇痛作用[20]。五爪金龙对农作物病害及农作物病原菌生长的影响目前尚无报道。本课题组近期研究发现，五爪金龙乙醇提取物能较好地抑制香蕉枯萎病病原菌的生长，但具有抗菌活性的化学物质尚不清楚。因此，本研究对五爪金龙乙醇提取物化学成分进行研究，以期从中找到具有抑制香蕉枯萎病病原菌的物质基础，为植物源绿色农药的开发提供先导化合物，并为五爪金龙的应用和香蕉枯萎病的生物防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

五爪金龙于2017年6月采自福建农林大学校园内。香蕉枯萎病病原菌Fusariumoxysporumf.sp.cubenseFOC菌株由福建农林大学农学院提供。马铃薯购于福建农林大学爱购超市，葡萄糖和琼脂购于贝尔曼公司。

1.2 试验仪器

核磁共振波谱仪(Bruker)、高分辨质谱(Agilent)、旋转蒸发仪(东京理化器械株式会社)、超净工作台(苏净安泰VS-840K-U)、人工气候箱(杭州绿博仪器)、高压灭菌锅(上海左乐仪器有限公司)。HP20SS树脂(日本三菱)、硅胶(200～300目，青岛海浪硅胶干燥剂厂)、MCI-gel CHP20P(75～100 μm，Mitsubishi Chemical Co.,Ltd.)、Rp-18(40～60 μm，Merck)。薄层层析用预制硅胶GF-254(青岛海浪硅胶干燥剂厂)。

1.3 提取与分离

称取五爪金龙干重1.5 kg，粉碎，用乙醇浸提24 h，过滤得滤液，重复提取3次，合并滤液、浓缩，得五爪金龙乙醇提取物浸膏(325.27 g)。用甲醇溶解浸膏，然后用石油醚进行萃取，分别得到石油醚萃取层和甲醇层两部分。甲醇层经硅胶拌样后上硅胶柱(d=12 cm，样品柱高1 m)，用石油醚∶丙酮按不同梯度洗脱(30∶1、20∶1、10∶1、8∶1、6∶1、4∶1、2∶1、1∶1)，每个梯度冲10 L，洗脱下来的馏分用薄层层析板监控，将显色一致的部分合起来，得到8个部分：Fr.1～Fr.8。

Fr.4经HP20SS、C18柱层析和Sephadex LH-20柱层析，得到化合物1(16 mg)。Fr.5经HP20SS、C18柱层析和Sephadex LH-20柱层析，得到化合物2(11 mg)和化合物3(10 mg)。

1.4 抗菌活性测定

化合物浓度配制：分别称取各个化合物1 mg于10 mL容量瓶中，定容，得到浓度为100 μg·mL-1的样品。取浓度为100 μg·mL-1的样品2 mL和1 mL，分别定容至4 mL，获得浓度梯度为50 μg·mL-1和25 μg·mL-1的样品。得到浓度分别为100、50、25 μg·mL-1的溶液。

培养基配制(PDA)：称取去皮的土豆300 g，切碎加水400 mL蒸煮30 min，用纱布过滤得澄清滤液，加入葡萄糖、琼脂粉各30 g，搅拌至充分溶解，定容至1 500 mL，置于高压灭菌锅中灭菌30 min，待用。

抑菌试验：将灭菌后的培养基倒入培养皿中，冷却，待用。将配制好的浓度为100、50、25 μg·mL-1样品用0.2 μm滤膜过滤，分别取过滤后的样品200 μL均匀涂到培养基上，每个浓度设置3个重复作为处理组，以均匀涂布200 μL甲醇的培养基作为对照。用打孔器将香蕉枯萎病病原菌的菌饼打成直径0.5 cm的圆饼，将病原菌分别接到涂有单体化合物和甲醇的培养基上，封口，置于28℃、湿度RH为60%的培养箱中培养5 d，每日观察1次，观察病原菌生长情况，并拍照、记录数据。

抑制率(%)=(r1-r2)/r1×100

式中，r1为对照培养基菌丝半径(cm)，r2为50 μg·mL-1浓度培养基菌丝半径(cm)。

2 结果与分析

2.1 化合物结构鉴定

化合物1为淡黄色针晶。从碳谱13C-NMR和DEPT谱上可以看出，化合物含有10个碳，包括1个甲氧基、4个次甲基和5个季碳。在13C-NMR谱图上，化学位移为δC∶161.8处的峰，表明化合物1中含1个酯羰基。1H-NMR谱图显示4个烯氢δH：6.22、6.83、7.01、7.84。上述信息表明化合物1为香豆素类化合物，与文献[21]数据比较确定化合物1为东莨菪亭内酯(图1)。

图1 化合物1结构图

化合物1核磁数据为1H-NMR(CD3OD,400 MHz)δ：6.22 (1H,d,J=9.0 Hz,H-3),7.84(1H,d,J=9.0 Hz,H-4),6.83(1H,s,H-5),7.01(1H,s,H-8),3.83(3H, s, H-11)·13C-NMR(CD3OD,100 MHz)δ：161.8(C-2),113.4(C-3),143.5(C-4),110.2(C-5),145.9(C-6),145.3(C-7),102.7(C-8),111.8(C-9),149.6(C-10),56.1(C-11)。

化合物2为白色针晶，分子式为C7H6O5；化合物2核磁数据为1H-NMR(CD3OD,600 MHz)δ：6.88(2H,s,H-2/6),8.81(1H,s,HO-4),9.09(2H,s,HO-3/5),12.20(1H,s,-COOH).13C-NMR (CD3OD,150 MHz )δ：119.8(C-1),108.9(C-2),144.9(C-3),137.9(C-4),153.8(C-5),108.5(C-6),167.2(-COOH)。以上数据与文献[22]报道数据一致，确定化合物2为没食子酸。

化合物3为无色针状晶体，与实验室分离得到β-谷甾醇对照品用相同溶剂系统进行薄层鉴别，发现二者Rf值相同，确定化合物3为β-谷甾醇。

2.2 抑菌活性测试结果

抑菌活性测定5 d后观察镰刀菌生长情况，发现东莨菪亭内酯(化合物1)在50 μg·mL-1的浓度下可以明显抑制香蕉枯萎病病原菌的生长(图2)，在100 μg·mL-1和25 μg·mL-1的浓度下对香蕉枯萎病病原菌的生长没有影响。没食子酸(化合物2)和β-谷甾醇(化合物3)对香蕉枯萎病病原菌的生长无明显影响。

注：处理组为培养基表面涂抹200 μL单体化合物，对照组为培养基表面涂抹200 μL甲醇

3 结论与讨论

本研究从入侵植物五爪金龙乙醇提取物中分离鉴定出3个单体化合物，其中东莨菪亭内酯(化合物1)在50 μg·mL-1浓度下对香蕉枯萎病病原菌的生长具有很好地抑制效果，有望开发成环境友好型的植物源生物农药，用于香蕉枯萎病的防治，并且为合成新型杀菌剂提供先导化合物。前期研究表明，东莨菪亭内酯在五爪金龙茎中含量高达6 μg·g-1，对福寿螺具有很强的毒杀作用，其在50 μg·mL-1的浓度下对水稻和稗草幼苗的生长具有促进作用[23]。

传统上认为五爪金龙为入侵杂草，为有害植物。本研究结果发现五爪金龙次生代谢产物具有抗作物病原菌的功能，研究结果可为五爪金龙的开发和应用提供理论依据，并为香蕉枯萎病以及由尖孢镰刀菌所引起的其他农作物病害的防治提供了新的策略。香蕉枯萎病为土传病害，五爪金龙根系分泌物中是否含有东莨菪亭内酯以及其在根系分泌物中的含量、五爪金龙与香蕉间作是否能减轻香蕉枯萎病的发病率等问题仍有待于进一步研究。