泉州市水葫芦致病真菌的分离与鉴定

郑凯玲，杨意伯，李锦泉，谢少和

(泉州市农业科学研究所， 福建 泉州 362212)

水葫芦，又名水浮莲、布袋莲、凤眼莲，属雨久花科凤眼莲属，原产于南美洲，自20世纪初传入我国，20世纪50～60年代作为猪的饲料源被广泛应用，后因其营养价值低，精饲料的推广等原因逐渐被人们放弃，逸为野生。由于脱离了原产地天敌和各种自然因素的制约，再加上其本身极强的繁殖扩散能力，目前水葫芦的生长范围遍及我国的17个省(自治区)，已成为我国近年来危害最为严重的恶性水生杂草之一[1]。从21世纪初开始，由于水质富营养化等原因，泉州地区河流中水葫芦的发生量逐年增多，生长条件适宜时能在短期内大量繁殖，大面积覆盖沟渠、河流和水库等的水面，造成江河航道受阻、拦河闸堵塞、桥基受冲击以及社区卫生环境恶化等一系列严重的社会、经济和生态问题[2-3]。

目前泉州市对水葫芦的防治主要依靠人工打捞和化学防治，费时费力且易对自然生态环境产生消极作用，采用生物防治是防治水葫芦安全有效的方法[4-6]。国外水葫芦天敌的调查从20世纪60年代开始，共发现了70多种取食水葫芦的节肢动物和3种螨类，此后又不断有水葫芦盲蝽Eccritotarsuscatarinensis等新天敌在巴西等地被发现。目前国际上已发现具有生防潜力的生物有水葫芦象甲Neochetinaeichhorniae、N.bruchi、水葫芦螟蛾Haimbachinainfusella、Sameodesalbigutsalis和叶螨Orthogalumnaterebrantis，其中最早和最成功的为水葫芦象甲在水葫芦生物防治上的应用。20世纪70年代后期，水葫芦致病菌被作为水葫芦生物控制的新手段，已先后收集到60多种具有生物控制潜力的病原菌，这些病原菌的大多数菌株均来自水葫芦入侵地。利用罗德曼尾孢Cercosporarodmanii防除水葫芦在国外已获专利保护[7-8]。

近年来的调查发现，水葫芦在我国国内已有一些本土天敌动物，如短额负蝗Atractomorphasinensis、中华蚱蜢Acridachinensis、中华稻蝗Oxyachinensis、斜纹夜蛾Spodopteralitura、莲缢管蚜Rhopalosiphumnymphaeae以及1种叶螨、1种扁螺。利用本土的绣球叶螨Tetranychushydrangeae来防治水葫芦已获得国内专利保护[9]。国内水葫芦致病菌的筛选工作始于20世纪90年代末，目前已分离获得的致病真菌有链格孢Alternariaspp.、A.eichhorniae、炭疽菌Colletotrichumspp.、石楠拟盘多毛孢Pestalotiopsisphotinia和冬青丽赤壳菌Calonectriailicicola等。露湿漆斑菌Myrotheciumroridum和水葫芦拟盘多毛孢P.crassipes这2个菌株在国内已获专利保护[6，8，10-12]。而福建省对水葫芦天敌种类的调查报道甚少，仅有杨闻笛[13]观察到斜纹夜蛾取食水葫芦，可造成水葫芦枯萎、死亡；李文文[14]从水葫芦黑斑病上分离到互隔链格孢A.alternata，将该菌接种于16种蔬菜及杂草上，发现除水葫芦和水浮莲有感染外，其他作物均未感病；曹阳[15]从水葫芦病叶上分离到尾孢菌Cercosporapiaropi，国际上普遍认为该菌是高效的水葫芦致病菌。本研究针对泉州市水域中自然发病的水葫芦，开展病原真菌的收集和培养以及病原真菌分类学地位的鉴定等一系列调查研究工作，从中分离获得对水葫芦具有潜在控制能力的病原真菌，充实水葫芦天敌种类名录，为具有生防潜力微生物的实际利用和生物除草剂的开发提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1供试菌株 从泉州市农业科学研究所农业科技园区采集带回具有典型病斑的水葫芦叶片和叶柄，并对其发病情况、侵染情况进行记载，通过组织分离法获得病原真菌。

1.1.2供试植株 从泉州市农业科学研究所农业科技园区水塘采集健康水葫芦，去除衰老叶片后移植到泉州市农业科学研究所天台上的放养容器内，加适量肥水，在自然条件下生长。

1.1.3供试培养基 马铃薯葡萄糖(PDA)培养基：去皮马铃薯200 g，加水煮烂后过滤，加入葡萄糖15 g，溶解后定容至1 000 mL(固体培养基加琼脂粉18 g，液体培养基不加)，120℃灭菌20 min。

1.2 试验方法

1.2.1水葫芦病害调查 在泉州市农业科学研究所农业科技园区水塘定点观察，记录该水域内水葫芦全年病害发生种类及受害程度，将发病植株带回实验室。

1.2.2水葫芦病原菌的分离与纯化 采用组织分离法。选取具有典型病斑的叶片或叶柄，表面用无菌水冲洗干净后，从病健交界处剪取约5 mm×5 mm的病组织数块，在超净工作台中将病组织块放入75%乙醇中消毒2次，后放入无菌水中连续漂洗3次，最后置于PDA平板培养基上，于25℃恒温培养箱中倒扣培养。待平板培养基上的菌落长出时，纯化并经致病性测定后移入试管斜面生长，长满斜面后置于冰箱4℃下保存备用。

1.2.3水葫芦病害的诊断与回接 (1)将分离纯化所得的病原菌切成5 mm×5 mm大小的菌块，菌丝一面贴于水葫芦叶片上，盖上湿棉花。接种前用无菌水将叶片表面冲洗干净，针刺接种点。以只贴湿棉花的植株作对照。在每个处理叶片套无色透明的聚乙烯塑料袋，叶柄处扎紧。接种植株置于27℃，植物生长灯下生长。7 d后，取下袋子，观察记录叶片上的病斑大小、坏死情况。(2)从分离纯化所得的病原菌菌落上切取菌丝块，接种于马铃薯葡萄糖培养液中，27℃、120 r·min-1振荡培养4 d后，用搅拌机打碎菌丝，按菌液与无菌水的体积比例(1∶3)配制成菌丝悬浮液。喷雾接种于健康水葫芦上，以只用无菌水喷雾的水葫芦作对照，每种菌液喷雾2～6株水葫芦，每株水葫芦5～9片叶。接种后套上无色透明的聚乙烯塑料袋，在自然温度和光照下生长。接种7 d后揭去塑料袋，观察各植株的发病情况。(3)利用柯赫法则进行回接验证，即被接种叶片出现症状后，通过组织分离法再次对病原菌进行分离，比较前后分离所得菌株的培养性状、孢子囊、分生孢子等形态特征。

1.2.4水葫芦病原菌鉴定 (1)形态学鉴定：将病原菌接种于PDA平板上，27℃黑暗培养5 d，观察菌落颜色、形状等培养性状。刮取菌丝，观察菌丝、孢子囊、分生孢子等形态特征，将菌种鉴定到属。(2)分子生物学鉴定：采用CTAB提取法提取病原菌总DNA。采用ITS通用引物ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)和ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)，以提取的病原菌样品DNA溶液作为模板，扩增rDNA-ITS片段。PCR扩增程序：95℃预变性3 min；95℃变性1 min，52℃退火55 s，72℃延伸1 min，循环30次；72℃补充延伸10 min。PCR产物经1%琼脂糖电泳检测后由华大基因测序。将获得的序列在GenBank数据库中进行BLAST比对分析，结合病原菌的形态学特征进一步确定病原菌的分类地位。

2 结果与分析

2.1 水葫芦病害发生情况

泉州市农业科学研究所农业科技园区水塘的水葫芦全年都有病害发生，其中以叶枯病最为明显，可造成大量叶片枯萎(图1A)。叶片发病后，先在叶尖产生黑褐色坏死，再向叶缘与叶柄延伸；叶面病斑初呈黑色的点状，面积扩大呈不规则的长条形，病健交界清晰或模糊；病斑连结形成中央黄褐色的大面积坏死，病部周围叶黄，发病严重时整叶枯死，坏死部位向叶柄蔓延(图1B、C、D、E)。

图1 水葫芦叶枯病症状

2.2 病原菌的分离与鉴定

通过对水葫芦病株进行分离、纯化和回接，得到2种水葫芦病原菌，分别将它们命名为YQ21和YQ36。

2.2.1菌株YQ21的鉴定 YQ21在PDA培养基上的菌落呈近圆形，边缘清晰；菌丝埋生，或表生，气生菌丝绒毛状，菌落初为青绿色后渐变为黑灰色，背面灰绿色至黑绿色。分生孢子链生，倒棒状，卵形、倒梨形或近椭圆形，淡褐色至褐色，成熟孢子具3～7(多数3～5)个横隔膜，2～4个纵、斜隔膜(图2)。根据菌落形态、分生孢子的形状、隔膜数等特征鉴定该菌属于链格孢属真菌。

图2 菌株YQ21的菌落及其分生孢子形态

利用真菌通用引物ITS4/ITS5扩增菌株YQ21的ITS区，得到1个大小为572 bp的扩增片段(图3)，经双向测序和GenBank数据库BLAST比对分析，发现该菌的ITS序列与互隔链格孢Alter-nariaalternata和细极链格孢A.tenuissima的相似度都很高，达到99.6%～99.8%，结合其形态特征将其鉴定为互隔链格孢Alternariaalternata。

注：M为200 bp DNA Marker条带

2.2.2菌株YQ36的鉴定 YQ36在PDA培养基上的菌落呈圆形，边缘清晰；菌落呈淡粉红色，气生菌丝不发达，菌落上有凸起物突破菌落表面；整个培养皿因该菌分泌水溶性红色色素而呈鲜红色。分生孢子单生，罕见链生，褐色，倒棒状或近椭圆形，具横隔膜 2～5个，纵、斜隔膜 1～4 个，分隔处略缢缩。喙柱状，与孢身之间分界不明显，淡褐色，不分隔(图4)。根据分生孢子的形状、隔膜数等特征鉴定该菌属于链格孢属真菌。

图4 菌株YQ36的菌落及其分生孢子形态

利用真菌通用引物ITS4/ITS5扩增菌株YQ36的ITS区，得到1个大小为570 bp的扩增片段(图5)，经双向测序和GenBank数据库BLAST比对分析发现该菌的ITS序列与水葫芦链格孢A.eichhorniae相似度高达99.9%，结合其形态特征将其鉴定为水葫芦链格孢A.eichhorniae。

注：M为200 bp DNA Marker条带

2.3 病原菌的致病性测定

2.3.1菌株YQ21的致病性测定 YQ21菌块接种产生圆形黑色坏死斑，外围有黄色晕圈(图6A)。菌液喷雾接种产生大小不等、不规则状、灰褐色至黄褐色的病斑，黄色晕圈明显(图6B、C、D)。

注：A为菌块接种；B～D为喷雾接种。

2.3.2菌株YQ36的致病性测定 菌块接种产生近圆形灰褐色坏死斑，外围有黄色晕圈(图7A)。菌液喷雾接种产生梭形黄褐色病斑(图7C)；湿度大时病斑呈黑色，病害向叶柄至茎部蔓延，叶片枯萎腐烂(图7D、E、F)。

注：A为菌块接种；B～F为喷雾接种

3 结论与讨论

从泉州市农科所农业科技园区的水葫芦叶枯病上分离得到两种病原菌互隔链格孢菌YQ21和水葫芦链格孢菌YQ36，说明该病害是由真菌复合侵染造成的，其中水葫芦链格孢菌YQ36为福建省内首次分离到的水葫芦病原菌，该菌的发现丰富了福建省水葫芦天敌微生物的资源库。但这两种病原菌能否作为水葫芦的生物防治菌还有待深入研究，现从这两种菌的致病研究进展论述其生防潜能。

3.1 互隔链格孢YQ21的生防潜力

国外对该菌株的研究较多，迄今为止发现其侵染对象有烟草、西红柿和大豆。国内李文文[14]从福建水葫芦病株上分离得到互隔链格孢，将该菌接种于16种蔬菜及杂草上，发现除水葫芦和水浮莲有感染外，其他作物均未感病。因此互隔链格孢菌对水葫芦具有相对的寄主专一性。但由于该菌能侵染烟草、西红柿和大豆，而西红柿和大豆在泉州地区有种植，因此该菌作为生防菌在泉州地区应用存在生态安全风险。

3.2 水葫芦链格孢YQ36的生防潜力

水葫芦链格孢因其寄主专一性而具有生防前景。国外已对该菌进行了生物安全性研究，研究中选取了21个属95种重要的经济作物进行寄主专一性和安全性测定，发现仅水葫芦感病，表明水葫芦链格孢菌具有较强的寄主专一性。长期研究结果表明，水葫芦链格孢能够作为一种安全、高效的水葫芦生物除草剂[8]。后续将结合泉州市的主要作物种类进一步研究该菌的寄主范围，探索该菌作为生防菌的可行性与开发应用价值。