超声辅助法提取辣椒多糖的工艺优化及其 抗氧化活性研究

辣椒（Capsicum annuumL.）属于茄科辣椒属植物，为一年生或多年生草本植物[1]。辣椒中含有如多糖、色素、辣椒碱和蛋白质等多种有效成分[2-3]，且具有一定的保健功能和营养价值，深受人们的喜爱[4]。

在辣椒的加工生产过程中，会产生大量的辣椒渣、辣椒杆等副产物。研究发现，辣椒渣中的多糖较为丰富[5]。植物多糖具有抗氧化[6]、抗肿瘤[7]、抗衰老[8]和免疫调节[9]等多种生物活性，甚至对艾滋病毒有一定的防御能力[10]，且具有毒副作用小和不易造成残留等优点[11]。国内外对辣椒渣中研究较多的为蛋白和膳食纤维，对多糖研究较少。而植物多糖的提取、功能性及应用是目前研究的重点[12]。本文以宁夏吴忠市农作物——辣椒为原料，采用超声辅助法提取辣椒多糖，在单因素试验的基础上，利用响应面试验优化辣椒多糖提取条件，并对产物进行体外抗氧化活性评价，为辣椒渣进一步的综合利用打下了研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

辣椒粉，无籽辣椒渣产自宁夏宁杨食品有限公司。

无水乙醇、抗坏血酸、Tris-HCl缓冲溶液、盐酸、PBS缓冲液、过氧化氢、DPPH、ABTS、邻二氮菲、过硫酸钾、铁氰化钾、邻苯三酚、磷酸钠、三氯醋酸、FeSO4以及FeCl3等，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

ME203E型电子天平，美国梅特勒公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器，巩义市予华仪器有限责任公司；KQ-250DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TDL-5-A型离心机，上海安亭科学仪器厂；V-5100型紫外-可见分光光度计，上海元析仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 辣椒多糖的提取

准确称取50.0 g辣椒粉末，加入400 mL 95%乙醇，80 ℃下回流提取3 h，提取2次，抽滤，收集滤渣干燥即为脱除辣椒素样品。取脱除辣椒素样品30.0 g，加入360 mL蒸馏水，超声波处理后，离心（4 500 r·min-1，20 min）除去滤渣和不溶物，合并滤液。将上述滤液减压并浓缩至挂壁状态，室温条件下，搅拌并加入80%的乙醇，于4 ℃条件下放置过夜，离心（4 500 r·min-1，10 min），得到沉淀物。将上述沉淀物真空干燥（真空度0.09，温度35 ℃，时间2 h），粉碎后即可得到辣椒多糖提取物。

1.3.2 辣椒多糖含量的测定

采用苯酚-硫酸法测定辣椒多糖的含量[13]。

（1）葡萄糖标准曲线的绘制。准确称取干燥至恒重的葡萄糖0.100 0 g，定容于100 mL容量瓶中，配制成葡萄糖标准溶液。取0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL和1.0 mL标准溶液分置于试管中，加蒸馏水至2.0 mL，再加5%的苯酚溶液1.0 mL，浓硫酸5.0 mL，摇匀，静置10 min后，沸水浴中加热30 min后冷却至室温，于490 nm处测定吸光度。用2.0 mL蒸馏水作为空白对照，制得葡萄糖标准曲线为y=16.031x+0.066 9（R2=0.993 8）。

（2）样液的测定。根据标准曲线计算得出待测液中葡萄糖的含量，做3次平行。辣椒多糖含量的计算公式：

式中：ω为辣椒多糖含量，mg·g-1；ρ为吸取的待测液中葡萄糖的浓度，mg·mL-1；f为葡萄糖换算多糖的换算因子，f=3.19；m为试样质量，mg。

1.3.3 单因素试验

以辣椒多糖含量为指标，分别考察料液比（1∶8、1∶10、1∶12、1∶14和1∶16）（g∶mL）、超声功率（125 W、150 W、175 W、200 W和225 W）、超声温度（40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃）以及超声时间（20 min、30 min、40 min、50 min和60 min）对辣椒多糖含量的影响。

试验过程中，各因素控制量分别为超声功率为175 W、超声温度为50 ℃、超声时间为30 min、料液比为1∶12（g∶mL）。

1.3.4 响应面试验

在确定单因素试验的较佳条件（超声功率150 W、超声温度70℃、超声时间40 min）的基础上进行Box-Behnken试验设计，以辣椒多糖含量为响应值，设计超声功率、超声温度、超声时间3因素3水平的响应面进行优化，见表1。

表1 响应面试验设计因素与水平表

1.3.5 辣椒多糖体外抗氧化活性评价

（1）超氧阴离子的清除活性的测定。采用YANG 等[14]的方法，取 0.05 mol·L-1，pH 8.2的 Tris-HCl缓冲溶液5 mL置于试管中，水浴中（25 ℃）预热20 min后，加入样品溶液1 mL，加入预热的3 mmol·L-1的邻苯三酚溶液0.5 mL，摇匀，于水浴中反应5 min，再加入8 mmol·L-1的盐酸1 mL，终止反应，在299 nm处测定溶液的吸光度。按式（2）计算样品对超氧阴离子的清除率。

式中：Ai为样品溶液的吸光度值；Aj为Tris-HCl缓冲液和邻苯三酚的吸光度值；A0为Tris-HCl缓冲液的吸光度值。

（2）羟自由基清除活性的测定。采用范艳丽等[15]的试验方法，根据式（3）计算样品对羟自由基的清除率。

式中：A0为空白对照品的吸光度；Ai为样品溶液的吸光度。

（3）DPPH自由基清除活性的测定。按梁万年等[16]的试验方法并做修改，取0.2 mmol DPPH溶液2 mL于试管中，加入2 mL样品溶液，摇匀，避光静置30 min。将2 mL DPPH溶液和2 mL乙醇混合作为空白对照。在517 nm处测定各反应混合物的吸光度。根据式（4）计算样品对DPPH自由基的清除能力。

式中：Ai为DPPH和样品溶液的吸光度；Aj为乙醇和样品溶液的吸光度；A0为DPPH和乙醇的吸光度。

（4）ABTS自由基清除活性的测定。按方甜等[17]的试验方法并做修改。将配制好的7 mmol·L-1的ABTS溶液与2.45 mmol·L-1的过硫酸钾溶液等体积浓度混合，避光放置12～16 h，得到ABTS+溶液。用蒸馏水稀释，使其在734 nm波长处的吸光值在（0.7±0.02），取ABTS+溶液3.9 mL，加入样品溶液0.1 mL，摇匀，室温放置6 min，于734 nm波长处测定吸光度，以维生素C作阳性对照。根据式（5）计算样品对ABTS+的清除能力。

式中：A0为空白对照品的吸光度；A1为样品溶液的吸光度。

（5）总还原能力测定。按李进等[18]的试验方法并做修改，取1 mL样品溶液于试管中，依次加入2.5 mL 的 0.2 mol·L-1磷 酸 钠 缓 冲 液（pH 6.6） 和1%铁氰化钾溶液2.5 mL，置于50 ℃水浴中，恒温20 min后，再加入10%的三氯醋酸溶液2.5 mL，3 000 r·min-1离心10 min，取上清液2.5 mL，加入蒸馏水2.5 mL和0.1%的FeCl3溶液1 mL，摇匀，静置10 min，在波长700 nm处测定其吸光度，以维生素C为阳性对照。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 料液比对辣椒多糖含量的影响

不同料液比对辣椒多糖含量的影响如图1所示。随着提取液的不断增加，辣椒多糖的含量先增加后减少。在料液比为1∶12时，辣椒多糖含量达到最大，随着提取液的继续增加，辣椒多糖含量呈现下降趋势。因此，选定料液比为1∶12（g∶mL）。

图1 料液比对辣椒多糖含量的影响图

2.1.2 超声功率对辣椒多糖含量的影响

超声功率对辣椒多糖含量的影响如图2所示。当超声功率为150 W时，辣椒多糖含量最大，之后随着超声功率增大而下降。这可能是因为超声功率的增大，破坏了辣椒多糖的结构。因此，选定超声功率为150 W。

图2 超声功率对辣椒多糖含量的影响图

2.1.3 超声温度对辣椒多糖含量的影响

超声温度对辣椒多糖含量的影响如图3所示。当超声温度为70 ℃时，辣椒多糖的含量最大，之后随着超声温度的升高，辣椒多糖的含量下降。原因可能是超声温度的不断升高，辣椒多糖容易溶出，但超声温度过高，部分辣椒多糖会分解，导致辣椒多糖的含量降低。因此，选定超声温度为70 ℃。

图3 超声温度对辣椒多糖含量的影响图

2.1.4 超声时间对辣椒多糖含量的影响

超声时间对辣椒多糖含量的影响如图4所示。随着超声时间的不断增加，辣椒多糖的含量也不断增大，超声时间为40 min时达到最大值，之后辣椒多糖的含量逐渐降低。因此，选定超声时间为40 min。

图4 超声时间对辣椒多糖含量的影响图

2.2 响应面优化试验结果分析

基于单因素试验，以超声功率、超声温度、超声时间为指标，采用Design Expertv8.0.6 Trial软件进行3因素3水平的Box-Behnken Design试验设计。整个试验设计在中心点处共有17次试验，试验随机完成，结果见表2。

分别对A、B、C各因素和响应值Y进行回归拟合，得到多糖含量（Y）一次多元回归方程为Y=84.85+22.01×A-1.28×B+1.03×C+0.45×A×B-0.55×A×C+0.30×B×C-2.51×A2-3.21×B2-3.28×C2。

表2 Box-Behnken响应面实验设计及结果表

该模型的方差分析结果见表3。回归模型P=0.012 8，表明该模型差异显著。失拟项P=0.676 5＞0.05，说明该模型拟合程度良好[19]。Design-Expert 8.0软件处理得响应面分析结果见图5～图7。

由图5～图7可知，3个响应因素在相对应的试验范围内对辣椒多糖含量有显著的影响。通过对各响应因素交互作用对综合评分影响的响应面及等高线图分析，使用Design-Expert软件对模型进行优化，获得的最优条件为超声功率158.03 W，超声温度68.48 ℃，超声时间41.10 min，此时辣椒多糖含量为42.35 mg·g-1。

2.3 最佳工艺条件试验验证

根据响应面优化的提取工艺条件，基于试验的实际可操作性，对其进行3次验证试验，考察工艺模型的稳定可靠性。根据修正后的模型优化的最佳提取条件（超声功率158.03 W，超声温度68.48 ℃，超声时间41.10 min）进行辣椒多糖的验证试验，由于试验条件限制，本次试验设定提取条件为超声功率150 W、温度68 ℃，超声时间41 min，重复测定3次，测得多糖的含量为（40.91±0.13）mg·g-1，与预测值（42.35 mg·g-1）误差较小。因此，此模型及相关参数准确可靠，能够预测试验的最佳工艺条件，可用于辣椒多糖的提取条件研究中。

表3 方差分析表

图5 超声功率和超声温度对辣椒多糖含量影响的响应面及等高线图

图6 超声功率和超声时间对辣椒多糖含量影响的响应面及等高线图

2.4 辣椒多糖的体外抗氧化活性测定

2.4.1 辣椒多糖对超氧阴离子自由基的清除能力

由图8可知，当样品浓度在0.1～0.4 mg·mL-1时，维生素C和辣椒多糖对超氧阴离子自由基清除率不断增加；当样品浓度在0.5 mg·mL-1时，维生素C的清除率能够达到99.25%，辣椒多糖的清除率达到74.84%。结果表明，辣椒多糖对超氧阴离子自由基有一定的清除能力，但维生素C比辣椒多糖的清除能力更强。

图8 辣椒多糖提取物对超氧阴离子自由基的清除能力图

2.4.2 辣椒多糖对羟基自由基清除活性的测定

由图9可知，当浓度为0.08 mg·mL-1时，维生素C对羟自由基的清除率为93.1%；辣椒多糖对羟自由基的清除率为76.6%。辣椒多糖对羟基自由基有一定的清除能力，但弱于维生素C。

图9 辣椒多糖提取物对羟自由基清除活性的测定图

2.4.3 辣椒多糖对DPPH+清除活性的能力

由图10可知，当样品的浓度为0.1 mg·mL-1时，辣椒多糖对DPPH+清除率为49%，浓度为0.4 mg·mL-1时，维生素C对DPPH+清除率达到100%。当浓度超过0.2 mg·mL-1时，辣椒多糖提取物对DPPH+清除率大幅度提升，浓度为0.4 mg·mL-1时其对DPPH+的清除率为70%左右。表明辣椒多糖提取物对DPPH+具有一定的清除能力，且与其质量浓度呈正相关。

2.4.4 辣椒多糖对ABTS+自由基清除活性的能力

由图11可知，当样品浓度在0.2～0.5 mg·mL-1时，维生素C和辣椒多糖对ABTS+自由基的清除率呈上升趋势。浓度为0.1 mg·mL-1时，辣椒多糖对ABTS+的清除率只有12%左右，其清除率随样品浓度的增大而增大。在浓度达到0.5 mg·mL-1时，辣椒多糖对ABTS+的清除率达到最大，为18%左右。结果表明辣椒多糖对ABTS+的清除能力较维生素C弱。

图10 辣椒多糖提取物对DPPH+清除活性的能力图

图11 辣椒多糖提取物对ABTS+清除活性的能力图

2.4.5 辣椒多糖的还原能力

样品的还原能力能够反映一定的抗氧化性，抗氧化剂可将Fe3+络合物还原成绿色或蓝色的Fe2+络合物。试验通过显色反应可以测定出Fe3+被还原成Fe2+程度的高低，从而可以判断出辣椒多糖还原能力的强弱。

由图12可知，随样品浓度的增大，维生素C的还原能力升高，辣椒多糖升高趋势较为缓慢。当浓度为1.4 mg·mL-1时，维生素C的清除率达到99.8%，而辣椒多糖的清除率最大为25%左右，说明辣椒多糖的还原能力弱于维生素C。

图12 辣椒多糖提取物的还原能力图

3 结论

本文采用超声辅助法提取辣椒多糖，通过单因素试验及响应面试验得到辣椒多糖的最佳提取工艺为超声功率150 W、温度68 ℃，超声时间41 min，在最佳工艺条件下，辣椒多糖含量为（40.91±0.13）mg·g-1，与预测值（42.35 mg·g-1）误差较小。辣椒多糖具有较好的抗氧化活性，其对超氧阴离子、羟基自由基和DPPH+具有较好的清除作用，但清除ABTS+能力和还原能力较弱。本文可为辣椒多糖提取工艺的工业化应用提供数据支持，同时为辣椒渣的利用提供借鉴思路。