胃癌患者血清Linc00659水平变化及其临床意义

单万硕，杨晶，张亚和

(万宁市人民医院 1.消化内科，2.肿瘤内科，海南 万宁 571500)

胃癌是发展中国家最常见的恶性肿瘤之一，其5年生存率低于20%，部分原因是由于缺乏有效的早期诊断方法和预后指标[1]。在不同类型的癌症中，基因组不稳定性与染色体畸变有关[2]。比较基因组杂交(CGH)数据表明，胃癌细胞中DNA拷贝数的增加经常出现在染色体20q长臂(20q13.33)上，其扩增解除了多种特定的癌症相关信号通路的调控[3- 4]。因此研究20q13.33扩增的lncRNAs有可能为胃癌诊断和靶向治疗提供新的见解。为了探索位于扩增的20q13.33上的lncRNAs的贡献，我们分析了癌症基因组图谱(TCGA)数据，鉴定了4种lncRNAs，即RTEL1- TNFRSF6B[5]、SLCO4A1- AS1[6]、ZBTB46- AS1[7]和Linc00659，它们在胃癌组织和癌旁组织中存在差异表达，然而只有Linc00659与胃癌患者的预后相关。而且目前对于Linc00659在胃癌发生中作用的关注度较低，因此本研究旨在通过生物信息学和临床研究进一步评估Linc00659在胃癌中的表达水平和生物学作用，进而为证实Linc00659是一种新的胃癌候选lncRNA提供可靠证据。

1 资料和方法

1.1 临床样本来源

从2017年12月至2020年9月，我们连续招募了226例胃癌患者(胃癌组)、67例癌前病变患者(癌前病变组)、70例胃良性病变患者(胃良性病变组)和45例健康对照者(健康对照组)。胃癌经胃镜检查结合活检确诊，之前接受过放化疗、细胞毒性治疗或靶向治疗的患者被排除在外。临床分期根据第八届美国癌症联合委员会(AJCC)肿瘤淋巴结转移(TNM)分期系统[8]确定。病理分级根据世界卫生组织的标准[9]确定。胃良性病变(包括慢性萎缩性胃炎、胃溃疡和胃息肉)和癌前病变(上皮内瘤变)通过内窥镜检查进行诊断，并通过活检进行确认。通过C13或C14呼吸试验确认幽门螺杆菌(Hp)感染。健康对照者是从在我院接受常规健康检查的人群中招募的，无可检测到的癌症或其他胃病，且肿瘤标志物水平正常。所有参与研究的受试者或其亲属均签署书面知情同意书。本研究得到了我院医学伦理委员会的批准，根据规定使用血清样本。

1.2 样本的获取及检测

根据标准方案采集血样。将20 ml静脉血吸入涂有EDTA的真空管中静置30 min，并在室温下以3 000 r·min-1的转速离心15 min。随后，用唯一标识符标记血清样本，并将其储存在-80 ℃下。此外，收集患者活检组织样本。应用TRIzol试剂(美国Invitrogen)提取血清或组织总RNA，使用HiFiScript cDNA合成试剂盒(中国北京康为世纪生物科技有限公司)将RNA反向转录成cDNA，使用PCR检测系统(LightCyler®480，中国上海罗氏诊断产品有限公司)和RealSYBR混合物(中国北京康为世纪生物科技有限公司)进行实时荧光定量PCR反应。扩增的热循环条件为：95 ℃ 5 min； 95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环；72 ℃ 10 min。将U6用作内部参考，以获得相对阈值周期(Ct)值。Linc00659的表达使用2-ΔΔCt方法计算，结果描述为平均值±标准差。Linc00659引物：正向5′- UUCUCCGAACGUGUCACGUTT- 3′，反向5′- ACGUGACACGUUCGGAGAATT- 3′；U6引物：正向5′- CTCGCTTCGGCAGCACA- 3′，反向5′- AACGCTTCACGAATTTGCGT- 3′。

1.3 TCGA数据分析

为了探索位于扩增的20q13.33上的lncRNAs的贡献，从TCGA数据库(http:∥cancergenome.nih.gov/)下载处理过的基因表达数据，包括胃癌患者的肿瘤样本(n=408)和正常样本(n=36)，收集每千个碱基的转录每百万映射读取的标准化片段数值(FPKM)，并将其转换为log2数据形式。根据Linc00659的中位表达水平(FPKM值=37)，将肿瘤样本分为高表达组和低表达组，5年总生存(OS)和无病生存(DFS)分析采用生存数据包(https:∥cran.r- project.org/web/packages/survival)在R软件中进行Kaplan- Meier生存曲线分析。

1.4 基因集富集(GSEA)分析

从GSEA网站(http:∥www.gsea- msigdb.org/gsea/downloads.jsp)下载GSEA 2- 2.2.3(JAVA版本)，然后导入下载的数据集。在MSigDB分子特征数据库(http:∥software.broadinstitute.org/gsea/msigdb)根据默认的加权富集统计方法，每次分析重复模拟1 000次。选择错误发现率<0.25和P<0.05的基因集。

1.5 目的基因预测

使用DESeq2包从Linc00659高表达和低表达组的肿瘤样本中获得差异表达基因(DEG)，|Log2倍变化(FC)|>1.5和调整后的P<0.01被用作DEGs分析的筛选阈值。使用clusterProfiler软件包对这些基因进行基因本体(GO)富集分析，以阐明其涉及的生物学过程、分子功能和细胞成分。同时，进行京都基因与基因组百科全书(KEGG)信号通路分析，以阐明哪些信号通路参与调控。通过计算Pearson相关系数和Z检验确定Linc00659共表达与所有蛋白编码基因(PCG)之间的相关性。与Linc00659正相关或负相关的PCG被认为是Linc00659相关PCG(| Pearson相关系数|>0.4，P<0.01)。

1.6 统计学处理

使用SPSS 22.0软件进行统计分析。所有实验至少独立进行3次，数据描述为中位值(四分位距)，进行K-S检验和Post- hoc检验，用Bonferroni法调整α值。Fisher精确检验或χ2检验用于分析Linc00659表达与临床病理参数之间的关系。绘制受试者工作特征(ROC)曲线，计算血清Linc00659水平诊断胃癌的曲线下面积(AUC)。采用Pearson或Spearman相关系数进行相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TCGA数据分析

通过TCGA数据库筛选，鉴定出4种位于20q13.33区域的lncRNAs，包括RTEL1- TNFRSF6B、SLCO4A1- AS1、ZBTB46- AS1和Linc00659，他们在胃癌组织中的表达水平显著上调(图1A、B)。Linc00659表达上调与不良预后相关(P=0.040，图1C)，与Ⅰ- Ⅲ期患者相比，Ⅳ期胃癌患者胃癌组织Linc00659表达水平显著升高(P=0.022，图1D)。RTEL1- TNFRSF6B、SLCO4A1- AS1、ZBTB46- AS1与OS或肿瘤分期无关(P>0.05)。

A. Linc00659位于Chr20q13.33上；B.位于Chr20q13.33上的4个lncRNAs的表达水平；C.使用对数秩检验分析胃癌患者(分为高和低Linc00659表达组)的总生存率和无病生存率；D.不同临床分期胃癌组织中Linc00659的表达差异图1 TCGA数据库分析

2.2 GSEA分析

使用TCGA数据对胃癌中Linc00659表达水平进行GSEA分析，结果表明Linc00659表达水平与上皮细胞迁移和上皮间充质转化途径相关(图2)。 GO和KEGG分析显示，Linc00659潜在的DEGs主要聚集在钙信号通路、磷酸化通路和黏附相关通路。

图2 胃癌中Linc00659表达水平的GSEA分析

2.3 TCGA数据库中与Linc00659共表达相关的蛋白编码基因

Pearson相关分析显示，含有GTPase激活蛋白3(IQGAP3)、基质金属蛋白酶15(MMP15)、整合素亚单位α6(ITGA6)、G蛋白偶联受体C组5成员A(GPRC5A)、TNF受体相关因子4(TRAF4)、角蛋白8(KRT8)、吞噬和细胞运动3(ELMO3)7种基因的表达水平与Linc00659的表达呈正相关(图3)。

图3 TCGA数据库中与Linc00659共表达的7种蛋白编码基因的相关性分析

2.4 临床样本中Linc00659表达水平的差异

胃癌组、癌前病变组、胃良性病变组、健康对照组血清Linc00659表达水平分别为2.09(1.53，3.13)、1.37(1.01，2.36)、1.17(0.85，1.65)、0.94(0.72，3.13)，胃良性病变组、健康对照组相比差异无统计学意义(P>0.05)，但是胃癌组、癌前病变组血清Linc00659水平均高于胃良性病变组、健康对照组(P<0.05)，而且胃癌组较癌前病变组升高更显著(P<0.05)。此外，胃癌患者活检组织Linc00659表达水平[3.15(2.12，3.99)]高于胃良性病变组[1.80(1.23，2.50)，P<0.05]和癌前病变组[2.12(1.56，3.01)，P<0.05]，而且癌前病变组活检组织Linc00659表达水平高于胃良性病变组(P<0.05)。Spearman相关分析显示，胃癌患者血清Linc00659水平与活检组织Linc00659表达水平呈正相关(r=0.715，P<0.001)。ROC曲线分析显示，血清Linc00659用于胃癌诊断以及区分胃癌和癌前病变患者的AUC为0.841(95%CI0.800～0.882)、0.797(95%CI0.739～0.855)，见图4。

图4 血清Linc00659用于胃癌诊断以及区分胃癌和癌前病变患者的ROC曲线分析

2.5 胃癌患者术前血清ITGβ6水平与临床特征的关系

根据血清Linc00659基线水平中位值，将患者分为高水平亚组(>2.09)和低水平亚组(≤2.09)。在临床病理特征中，pT分期(P=0.033)、pTNM分期(P=0.036)、血管侵犯(P=0.001)、微卫星不稳定性(MSI)(P=0.004)与血清Linc00659基线水平相关(表1)。

表1 胃癌患者术前血清Linc00659水平与临床特征的关系 例

(续表)

3 讨 论

越来越多的研究表明，lncRNAs在癌症中起着关键作用，尽管在人类基因组中发现了大量lncRNAs，但只有少数lncRNAs经过实验验证，并在胃癌中进行了功能注释[10- 12]。胃癌的起始和进展涉及多种lncRNAs的调控或去调控。一些lncRNA功能已被发现，并有望成为胃癌预后和治疗的潜在生物标志物和治疗靶点[12- 13]。基因组扩增是癌症的标志，通常使用定位于扩增子上的非编码元件(如lncRNAs)来描述它们在恶性转化中的作用[14]。在本研究中，我们证实Linc00659在胃癌血清样本和活检组织样本中的表达量增加，初步临床数据显示Linc00659与胃癌恶性化进展相关，且血清Linc00659有望成为胃癌诊断生物标志物。

在不同类型的癌症中，基因组不稳定性与染色体畸变有关，这可能涉及多种抑癌基因突变，并进一步促进肿瘤进展[2,15]。比较基因组杂交(CGH)数据表明，DNA拷贝数的增加经常出现在染色体1q、3q、5p、7p、7q、8q、11q、17q、20p和20q上，而在胃癌细胞中的染色体3p、4p、4q、8p、9p、18p、18q、20q上经常检测到一个拷贝的丢失[2- 4,15,16- 18]。在胰腺癌、乳腺癌、结肠癌和胃癌等多种类型的癌症中已经观察到几种染色体畸变，尤其是20q的扩增，这意味着20q的增加可能在肿瘤发生中起着至关重要的作用。染色体20q上的扩增基因包含各种功能上重要的基因，这些基因涉及细胞周期调节(E2F1、TPX2、KIF3B、PIGT和B4GALT5)、核功能(CSEL1)、病毒复制(PSMA7和LAM5)、甲基化和染色质重塑(ASXL1、AHCY和C20orf20)以及转录调节(TCEA2)[15- 19]。染色体20q的扩增解除了几种特定的癌症相关信号通路的调控，包括MAPK和p53信号通路[4,15]。在TCGA数据库中，胃癌患者组织Linc00659表达上调与不良预后相关。染色体重复和基因扩增的改变对癌基因的功能获得和过度表达至关重要。根据CGH分析，在包括胃癌在内的多种类型的癌症中观察到了几种染色体畸变，尤其是20号染色体长臂(20q13.33)的反复增益和扩增。CGH经常在20号染色体上扩增，该染色体在20q13.33中有许多胃癌易感性位点[2- 4,15]。为了探索位于扩增20q13.33上lncRNAs的贡献，我们通过筛选TCGA数据库分析胃癌中lncRNAs的表达水平。与非肿瘤组织相比，发现4种lncRNAs，即RTEL1- TNFRSF6B、SLCO4A1- AS1、ZBTB46- AS1和Linc00659在胃肿瘤组织中的表达水平显著上调。随后，使用对数秩检验进行Kaplan- Meier分析，证实与低水平Linc00659表达的患者相比，高水平Linc00659表达的患者OS时间显著缩短。此外，与Ⅰ- Ⅲ期患者相比，晚期胃癌(Ⅳ期)患者组织Linc00659表达水平显著升高，而其他3种lncRNAs与肿瘤分期或生存预后无关。这些数据表明，Linc00659表达水平升高的胃癌患者可能更容易进展到疾病晚期，这与本研究中收集的我院临床样本数据基本相符。

之前有研究表明，Linc00659是一种新的致癌lncRNA，敲除Linc00659表达可损害细胞周期进程，并抑制PI3K- AKT信号传导，进而显著抑制结肠癌细胞增殖[20]。随后Sheng等[21- 22]研究也证实，Linc00659在胃癌细胞系SGC- 7901和BGC- 823中表达增加，共表达分析进一步揭示了转录因子SUZ12和Linc00659之间的相关性。在本研究中，血清Linc00659在胃癌患者中的表达被证明是上调的，且其高表达水平与临床分期进展和血管侵犯相关。此外，ROC曲线分析证实，血清Linc00659对于胃癌诊断以及区分胃癌和癌前病变患者都具有良好的临床效能，AUC值分别为0.841(95%CI0.800～0.882)和0.797(95%CI0.739～0.855)。利用GSEA分析证实，在高Linc00659表达表型中，上皮细胞迁移和上皮间充质转化途径的负调控显著差异富集。通过GO和KEGG分析显示，Linc00659潜在的DEGs主要聚集在钙信号通路、磷酸化通路和黏附相关通路。这些数据表明，Linc00659的功能可能与参与胃癌转移的细胞迁移和侵袭有关。这也为Linc00659用于胃癌候选诊断和治疗靶点提供了证据支持。

尽管本研究提高了我们对Linc00659与胃癌之间关系的认识，但仍存在一些局限性。首先，为了充分阐明Linc00659在胃癌发展和进展中的特殊作用，应包括所有临床因素，如患者治疗细节及预后。然而，在本研究中，此类信息缺乏或处理不一致。其次，本研究只提供了临床样本数据和生物信息分析，没有进行基础实验验证。下一步的工作需要进行综合的、完善的体外和动物体内基础实验分析。第三，单组学对基因功能的理解并不全面，因此应扩展到多组学研究，尤其是蛋白质水平及其功能机制的研究。第四，缺少外部数据集验证可能会导致偏差。

总之，目前的临床研究结果表明，Linc00659有望成为胃癌诊断和恶性进展的一个重要分子标志物，在将来也可能成为一个新的有前途的治疗靶点。而且上皮细胞迁移和上皮间充质转化途径可能是Linc00659促进胃癌进展的假定分子机制，尽管其机制需要进一步研究。