金叶复叶槭水培嫩枝组织培养体系研究

张焕玲

(西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100)

金叶复叶槭(Acernegundo‘Aurea’)属槭树科槭树属落叶乔木，是复叶槭的一个栽培变种。金叶复叶槭小枝光滑，奇数羽状复叶对生，春季色泽金黄，观赏性极高[1-2]。其生长快，耐干旱、极耐寒冷、耐轻度盐碱，我国于20世纪初从欧洲引进，目前在华北、东北、西北及华东地区均有栽培[3]。因其扦插生根困难，生产中主要采用嫁接繁殖[1]，但在嫁接繁殖中不亲和现象较为普遍，后期树势衰退严重。利用组织培养技术不仅可以快速建立其快繁体系，还能促进品种改良和分子育种研究的开展。

1 材料与方法

1.1 材料

以金叶复叶槭3年生休眠枝温室水培嫩枝为外植体。休眠枝采自杨凌大石景观苗木基地从辽宁引进的金叶复叶槭5年生大苗，于1月中旬采集后水培，水培时枝条上端套1塑料袋，每3 d换水1次，同时修剪枝条下切口。

1.2 方法

1.2.1 初代培养及基本培养基筛选

待休眠枝萌发嫩枝长至15 cm左右长时，将其剪成带1个腋芽的茎段，按照体积分数75%酒精浸润 50 s、无菌水冲洗3次、质量分数0.1%氯化汞消毒8 min、无菌水冲洗5次的程序消毒，消毒后修剪茎段两端约2 mm后接种在不含任何附加物的不同培养基中培养50 d，观察统计接种外植体的腋芽萌发率及长度，以筛选适合的基本培养基。选用3种基本培养基，即富集元素平衡培养基MS、高硝酸钾含量培养基B5和低盐培养基WPM。

1.2.2 茎段增殖培养

将初代培养中获得的无菌茎段接种在含不同浓度生长素和分裂素的基本培养基中培养，以筛选适合的增殖培养基。

生长素和分裂素筛选采用逐步筛选的单因素试验设计，先将修剪好的带1个腋芽的无菌茎段接种在附加0.5 mg/L 6-BA、不同质量浓度NAA(0.02、0.04、0.06、0.08 mg/L)的培养基中培养，以筛选有利于茎段增殖的NAA浓度。再将材料接种在含上述筛选出的NAA、不同质量浓度6-BA(0.3、0.5、0.7、0.9 mg/L) 的培养基中，以筛选有利于茎段增殖的6-BA浓度。最后将材料接种在含上述筛选出的NAA、6-BA、不同质量浓度的TDZ(0.00、0.01、0.05、0.10 mg/L)的培养基中，筛选有利于茎段增殖的TDZ浓度。培养45 d后，统计每个外植体的增殖芽数、长度，观察记录芽的长势。

1.2.3 生根培养

将增殖培养中获得的2～3 cm的段分别接种于含不同质量浓度IBA及不同质量浓度NAA(0.00、0.03、0.05、0.07、0.09 mg/L)的1/2 MS基本培养基中进行生根培养，观察统计初生根时间、50 d时的生根率及生根苗生长情况，以筛选生根培养基。

1.2.4 炼苗移栽

当生根苗根长至3～6 cm时，将瓶盖半开，在培养室炼苗3 d后进行移栽。移栽时先用镊子轻轻夹出幼苗，在水中轻柔冲洗根部培养基，移栽至装有商品化育苗细基质的培养容器中，置于人工气候箱内培养至恢复生长，培养箱相对湿度设置为85%，以30%(接近室内湿度)为对照。

1.2.5 培养条件与重复数

所有实验培养条件为于(25±2) ℃、16 h/d光照、2 000 lx光照度条件。每个实验处理接种25瓶，重复3次。

1.2.6 数据处理

对实验结果中增殖芽数、平均根数数据经平方根转换，百分率经反正弦转换后，用SPSS 20.0进行差异显著性检验。

2 结果与分析

2.1 基本培养基筛选结果

基本培养基是建立一个新植物组培体系时首要研究的问题。用于复叶槭组培的基本培养基报道不一致，故选取3种代表不同类型的培养基进行实验。结果表明，金叶复叶槭水培嫩枝在不添加任何附加物的MS、B5、WPM 3种培养基中均能成功诱导腋芽萌发。外植体接种3周后，腋芽开始萌动，露出绿点，5周后开始伸长。但在MS和WPM培养基中的萌发率要显著高于B5培养基(P<0.05)10余个百分点(表1)。MS和WPM培养基的主要区别在于无机盐浓度差异，B5与MS、WPM培养基的主要区别在于其含有高浓度的硝态氮，这说明金叶复叶槭茎段腋芽诱导的关键影响因素可能是N元素的供应形态，而非无机盐的浓度。

表1 不同培养基中的初代培养比较

尽管MS和WPM在腋芽诱导方面差异不显著，但对萌发新芽的伸长生长影响较大。在MS培养基中新芽生长快，30 d后平均长度超过2 cm(表1、图1A)。

A.MS培养基中的初代培养primary culture in MS medium；B.最佳增殖培养基中的增殖培养proliferative culture in optimum medium;C.0.05 mg/L IBA诱导生根root inducing with 0.05 mg/L IBA;D.再生组培苗regeneration plant。图1 金叶复叶槭不同组培阶段生长情况Fig.1 The growth situation in different cultural stages of A. negundo ‘Aurea’

而在WPM和B5培养基中新芽生长缓慢，平均长度在1.5 cm以下(表1)，这说明金叶复叶槭离体材料的伸长生长需要含较高浓度无机盐的培养基。

综上，从腋芽萌发率和新芽伸长生长综合考虑，最终选择MS作为金叶复叶槭组培的最佳基本培养基。

2.2 生长调节剂浓度对金叶复叶槭增殖培养的影响

2.2.1 NAA

以MS为基本培养基，固定细胞分裂素6-BA浓度(0.5 mg/L)，添加不同质量浓度的生长素NAA，研究了NAA对金叶复叶槭增殖培养的影响(表2)。

表2 NAA浓度对金叶复叶槭增殖培养的影响

从表2可看出，NAA质量浓度在0.02～0.08 mg/L范围内，随着NAA浓度的增加，金叶复叶槭每个外植体增殖芽数和芽平均长度均呈现升高趋势。0.02和0.04 mg/L，以及0.06和0.08 mg/L NAA中增殖芽数间无显著差异(P>0.05)，但0.06和0.08 mg/L NAA中的增殖芽数显著高于0.02和0.04 mg/L(P<0.05)。尽管0.06和0.08 mg/L NAA在增殖芽长度方面差异不显著(P>0.05)，但二者均显著高于0.02和0.04 mg/L NAA中的芽长(P<0.05)，芽长比前者增加了5～6倍，比后者增加了2倍左右。这些结果表明，在金叶复叶槭增殖培养中，与0.5 mg/L 6-BA搭配使用的NAA浓度至少要达到0.05 mg/L以上，二者浓度比在10∶1左右为宜。

另外，从增殖芽长势情况来看，在低浓度和高浓度NAA中增殖的芽生长都不正常，0.02和0.04 mg/L NAA中增殖的芽表现出“细弱”的典型特征，0.08 mg/L NAA中的则表现出“细长”的特征，说明NAA浓度过高或过低都会削弱增殖芽的长势。

2.2.2 6-BA

以MS为基本培养基，附加0.06 mg/L NAA，添加不同浓度的6-BA，研究了6-BA对金叶复叶槭增殖培养的影响。

细胞分裂素是植物组织培养增殖培养阶段必须添加的植物生长调节剂，实验结果(表3)表明，在0.3～0.9 mg/L质量浓度范围内，随着6-BA质量浓度的增加，外植体增殖芽数和芽长度均呈现先上升后下降趋势。增殖芽数最高的是含0.7 mg/L 6-BA的培养基，芽长度最长的是含0.5 mg/L 6-BA的培养基，当6-BA质量浓度达0.9 mg/L时，增殖芽数有所下降。当6-BA质量浓度超过0.7 mg/L时，外植体基部开始出现愈伤组织，影响营养物质的吸收，芽长度开始下降。尽管0.5和0.7 mg/L 6-BA中增殖芽数无显著差异(P>0.05)，但0.5 mg/L中的芽长度显著高于0.7 mg/L(P<0.05)，故选择0.5 mg/L 6-BA为增殖培养的最佳浓度。

表3 6-BA浓度对金叶复叶槭增殖培养的影响

2.2.3 TDZ

TDZ是人工合成的具有细胞分裂素活性的苯基脲衍生物，是被广泛用于植物组织培养形态发生的高效生物调节剂，具有生长素和细胞分裂素双重作用。为进一步提高金叶复叶槭增殖系数，在筛选6-BA(0.5 mg/L)和NAA(0.06 mg/L)的基础上,通过添加不同质量浓度的TDZ探究其是否有利于茎段增殖。

表4 TDZ浓度对金叶复叶槭增殖培养的影响

结果(表4)表明，添加TDZ能显著提高金叶复叶槭的增殖系数(P<0.05)，随着TDZ浓度的增加，增殖芽数呈现上升趋势。不添加TDZ时的增殖芽数平均只有4.1个，添加TDZ后最高可达6.6个，当TDZ质量浓度超过0.05 mg/L时，增殖芽数不再增加。低浓度的TDZ(0.01 mg/L)对芽伸长生长影响不显著(P>0.05)，但高浓度的TDZ(>0.05 mg/L)会抑制芽的生长，芽长度显著降低(P<0.05)。0.05 mg/L TDZ中增殖的芽平均长度比0.01 mg/L中短1 cm，且芽纤细，当TDZ质量浓度达0.10 mg/L时，增殖芽开始出现玻璃化现象。

综上，金叶复叶槭茎段增殖培养的最适培养基为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.01 mg/L TDZ+0.06 mg/L NAA，该培养基中每个外植体可增殖5.8个新芽，芽长势良好(图1B)。

2.3 NAA、IBA浓度对金叶复叶槭生根的影响

NAA和IBA是植物组织培养中生根培养常用的两种生长素，实验在1/2 MS培养基中通过分别添加不同浓度的NAA和IBA，研究了2种生长素对金叶复叶槭组培苗生根的影响。

由表5分析可得，培养基中添加IBA或NAA均可促进组培苗生根，无论是生根时间、生根数量，还是生根率，都比不添加任何生长素要好，但IBA生根效果要明显好于NAA。不添加任何生长素时最早生根需要25 d，生根率只有23.1%，平均根数2.8条，添加IBA后生根时间最多可提前12 d，生根率达100%，平均根数最多达9.1条(图1C)；添加NAA后对生根天数影响不大，但生根率可最高至78.3%，平均根数也显著增加，最多5.7条。研究发现，随着生长素浓度的增加，愈伤组织生根增多，当IBA质量浓度为0.07 mg/L、NAA质量浓度为0.09 mg/L时，新生根与茎基部有愈伤组织出现，愈伤组织生根会影响后期的移栽成活率，不利移栽。故最终选取1/2 MS+0.05 mg/L IBA为金叶复叶槭组培生根培养基,在该培养基中生长的组培苗长势良好(图1D)。

表5 不同NAA与IBA浓度生根效果比较

2.4 试管苗的炼苗移栽

金叶复叶槭试管苗叶片较大，蒸腾失水快，炼苗3 d的试管苗移栽至培养基质中，如不能保证足够的空气湿度，30 min 内就可出现叶片失水萎蔫现象(图2A)，1 d内叶片即可干枯，移栽成活率不到10%。相反，置于85%相对湿度下的移栽苗叶片失水较轻，轻度萎蔫3 d内即可恢复正常(图2B)，10 d即可恢复生长，移栽成活率高达95%。因此，保温是金叶复叶槭组培苗移栽成活的关键。

A.30%相对湿度30% relative humidity；B.85%相对湿度85% relative humidity;C.IBA诱导的组培苗根系roots of tissue culture plantlets induced by IBA。图2 金叶复叶槭组培苗炼苗移栽Fig.2 Acclimatization and transplants of A. negundo ‘Aurea’ tissue culture plantlets

移栽使用的基质是普通的商品化育苗细基质，在相对湿度85%的条件下并未发现移栽苗生长不良现象，说明金叶复叶槭组培苗移栽可能对基质要求不严，也可能是因为IBA诱导的试管苗根系与茎段连接处愈伤组织少，主、侧根均较粗壮(图2C)，易于移栽成活。

3 讨 论

1) 本研究以3年生休眠枝水培嫩枝为试材，建立了辽宁种源的金叶复叶槭组织培养体系，系统筛选了基本培养基、增殖培养基和生根培养基，移栽成活率高达95%，为该观赏树种良种快繁提供了新途径。研究结果显示，营养元素富集的MS培养基适合作为金叶复叶槭茎段培养的基本培养基，其诱导腋芽萌发性能要比B5和WPM培养基好。细胞分裂素与生长素的联合使用对增殖培养有利，低浓度的TDZ有助于提高不定芽增殖系数，0.5 mg/L 6-BA结合0.01 mg/L TDZ和0.06 mg/L NAA，可使每个外植体平均增殖5.8个新芽。生长素IBA和NAA均可有效促进组培苗生根，但IBA效果明显优于NAA，在1/2 MS附加0.05 mg/L IBA的生根培养基中生根率可达100%，较不添加生长素提升近75%。影响金叶复叶槭组培苗移栽的主要因素是空气相对湿度，85%的相对湿度可保证95%的移栽成活率。

2) 本研究所用外植体为室内水培休眠枝萌发的新枝，与生长季大田采集的外植体相比，有污染率小、消毒时间短、消毒剂对外植体伤害小的优点，这对初代培养十分有利。金叶复叶槭休眠枝休眠状态较难打破，水培枝条萌发需要较高温度和较长时间，但长时间下高温水培对枝条营养消耗和蒸腾失水影响很大，因此需要选择健壮的枝条并在相对湿润的环境下进行水培。

基本培养基是建立一个新植物组培体系时首要研究的问题，选择不当，会直接影响组培效果。目前植物组织培养领域常用的基本培养基达14种之多，根据成分可将其聚为4大类[14]，本研究选取了3大类当中的3种典型培养基，发现MS培养基的效果优于WPM和B5培养基，这与王艳辉等[2]的研究结果类似，但与李艳敏等[3]的研究结果不一致。李艳菊等[4]和马秋月等[5]在元宝枫组培中也发现同种培养基有不同的培养效果，这可能与基因型、外植体类型及状态有关，因为同一树种的不同基因型、不同外植体及同一外植体的不同状态都会要求不同的组培系统[15]。此外，是否可进一步通过微调MS培养基中各种成分的量，找到一种更优的改良MS培养基，或者其他10余种培养基是否比MS更好，值得进一步研究。

细胞分裂素和生长素联合使用是增殖培养的有效方法，从前人经验和经济角度考虑，多数研究都采用6-BA与NAA或IBA联合使用，均能起到一定的增殖效果，但增殖系数普遍不高[2,8,10,12]。研究发现很少量的TDZ即可产生明显的增殖效果[4，16]，本研究也证实0.01 mg/L的TDZ就可使每个外植体多增殖近2个新芽，但用量控制不当容易引起愈伤组织生根及玻璃化苗的产生。因此，寻找新的使用方便且高效的细胞分裂素类物质十分有必要。

金叶复叶槭试管苗生根相对容易，单独使用IBA即可100%生根，关键是如何调整浓度控制愈伤组织生根现象的发生。此外，本研究只对组培苗以半开瓶盖的方式进行了3 d的短时间培养室炼苗，保湿是按此方式炼苗后移栽成活的关键，是否可以通过全开盖、长时间、室温炼苗来提高组培苗对干旱的耐性应该是今后研究的重点。