Nel样1型基因对早期急性牙髓炎幼鼠牙髓损伤修复的作用及对Notch通路的影响*

武珂, 姜新亚, 陈颖, 张雪

郑州大学第一附属医院牙体牙髓科(河南郑州 450052)

急性牙髓炎主要指由细菌感染引起的牙髓组织急性炎症，以发病急、疼痛剧烈为主要特点，患者常有自发性阵发性痛牙、夜间痛、疼痛无法自行定位等症状[1-2]。牙髓组织位于牙齿内部的牙髓腔，包含血管、神经、淋巴组织等，当受到刺激时，表现为血管扩张，伴有充血现象，进而转化为急性牙髓炎[3]。临床上急性牙髓炎的治疗包括药物及手术等方式，手术类型主要包括活髓切除术、根尖诱导成形术等，药物治疗多作为辅助手段，常用抗生素及镇痛药物进行治疗，且一般镇痛药物效果不显著。由于部分患者存在恐惧、焦虑等不良情绪，往往因为害怕而不配合手术治疗，因此寻求可以替代手术的治疗方法极为重要。Nel样1型基因(Nel-like molecule-1，NELL-1)是一种在颅缝早闭患者早闭区过表达的基因，位于第11号染色体p15.1～p15.2，其编码形成的蛋白与成骨细胞分化有关[4-5]。体外研究表明[6]，NELL-1作为一种成骨蛋白，不仅参与颅骨骨化，而且与骨骼维护有关，通过注射给药可有效在动物模型上诱导骨骼形成。Notch是高度保守的跨膜蛋白受体，与细胞之间信息传递、损伤修复密切相关[7-8]。2019年4—10月，本实验通过建立幼鼠急性牙髓炎模型，明确NELL-1对牙髓损伤修复及对Notch信号通路的影响，研究经郑州大学第一附属医院伦理委员会审查通过(ZDYFY-20190359)。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂 含NELL-1序列(NELL-1)及其阴性对照(NELL-1 NC)，含NELL干扰序列(NELL-1-siRNA)及其阴性对照(NELL-1-siRNA-NC)的pcDNA3.1质粒(长沙艾碧维生物科技有限公司)，青霉素软膏(上海瀚尔升进出口有限公司)，反转录试剂盒(日本TAKARA公司)，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，兔抗大鼠NELL-1、Notch一抗(武汉艾美捷科技有限公司)、兔抗大鼠Delta-1一抗(北京百奥莱博科技有限公司)，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(北京全式金生物技术有限公司)。

1.2 仪器 脑立体定位仪(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)，高速涡轮机(佛山市兴斯医疗器械有限公司)，E-M10相机(日本Olympus公司)，WMS-1.35显微镜(上海无陌光学仪器有限公司)。

1.3 实验动物 5周龄SD大鼠90只，体重(150±10)g，雌雄各半，购自长春市亿斯实验动物技术有限责任公司，生产许可证号：SCXK(吉)2018-0007。所有幼鼠鼠牙牙体、牙列完整，无龋病、外伤性牙折现象，上下颌咬合关系正常。适应性饲喂7 d。

1.4 动物分组及干预 随机数字法将幼鼠分为对照组、模型组、NELL-1组、NELL-1-NC组、NELL-1-siRNA组、NELL-1-siRNA-NC组(n=15)。各组幼鼠腹腔注射0.3%戊巴比妥进行麻醉，置于手术板上，用脑立体定位仪将头部固定后，四周放置暖水袋并略抬高躯体垂直高度，头颈部备皮并消毒后，作一切口分离颈部肌肉，暴露第一寰椎及枕骨大孔，去除脑硬膜、蛛网膜并暴露延髓，将沾有肾上腺素的棉球置于延髓上方，根据脑定位图谱，将0.4 μL pcDNA3.1、NELL-1-pcDNA3.1、NELL-NC-pcDNA3.1、NELL-1-siRNA-pcDNA3.1、NELL-1-siRNA-NC-pcDNA3.1分别注射于模型组、NELL-1组、NELL-1-NC组、NELL-1-siRNA组、NELL-1-siRNA-NC组幼鼠枕骨大孔至尾端延髓脊髓交界处无血管位置，对照组仅暴露延髓。结束后，碘伏进行消毒，分层缝合肌肉皮肤，青霉素软膏对外层皮肤切口进行抗菌处理，室温下苏醒后，于温度20℃、湿度55%的安静环境下回笼饲养3周，期间正常饮食进水。

1.5 建模 饲养结束后，除对照组外，其余各组幼鼠采用内毒素诱导法[9]建模，用生理盐水将LPS稀释为5 mg/mL的溶液备用，腹腔注射0.3%戊巴比妥麻醉，将幼鼠呈仰卧位置于手术板上，固定四肢及上颌，充分暴露左侧上颌磨牙，用75%酒精消毒后，用高速涡轮机005号球钻在第一磨牙和第二磨牙颌面开髓，深度约1 mm，将浸润有LPS溶液的棉絮置于窝洞内，用玻璃离子暂封，各幼鼠于37℃苏醒后，放回饲养笼。建模结束3 d后进行后续试验，其中模型组死亡2只，NELL-1组死亡1只、NELL-1-NC组死亡3只、NELL-1-siRNA组死亡4只、NELL-1-siRNA-NC组死亡2只。对照组正常饲养。

1.6 检测指标

1.6.1 痛行为学检测 将各组幼鼠分别放入长、宽、高均为20 cm的透明玻璃罩内，底部放置相机实时拍摄记录，待幼鼠适应5 min后，记录3 min内每只幼鼠擦面行为总时间。结束后，75%酒精对玻璃罩内部进行彻底清洗，以防对下组实验造成影响。

1.6.2 血清中炎症因子检测 各组幼鼠尾静脉取血2 mL，经3 000 r/min离心5 min，取上层血清，根据ELISA检测试剂盒说明书进行实验，于450 nm波长处读取吸光度值，根据标准曲线计算TNF-α、IL-1β水平。

1.6.3 牙髓组织病理学观察 取幼鼠左侧上颌牙第一磨牙，于流动水下反复冲洗并用多聚甲醛固定12 h，置于EDTA中脱钙，梯度酒精中脱水后，用石蜡包埋，切片机切片，切片厚度4 μm。取切片用二甲苯脱蜡、酒精浓度由低到高脱水后，苏木精进行染色，经盐酸乙醇分化后，用伊红复染，脱水后用二甲苯透明，中性树脂封片，于显微镜下观察牙髓组织病理变化。

1.6.4 牙髓组织NELL-1 mRNA表达量检测 将幼鼠麻醉后，活体取出左侧上颌牙第二磨牙，剥离磨牙并去除牙周软组织，将磨牙牙髓用组织剪剪碎后磨成粉状，取30 mg用于mRNA表达量检测，其余牙髓粉末用于蛋白检测。用Trizol提取总RNA，并计算浓度。用反转录试剂盒获得cDNA，按照说明书进行PCR反应，反应条件：95℃ 5 min，95℃ 30 s，65℃ 1 min，72℃延伸30 s共40个循环。所用引物序列，NELL-1正向引物：5′-CTGTGTGGCTCCTAACAAGTGTG-3′，反向引物：5′-GGATTCTGGCAATCACAAGCTGCT-3′，GAPDH正向引物：5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，反向引物：5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法计算牙髓组织中NELL-1表达水平。

1.6.5 牙髓组织NELL-1、Notch、Delta-1蛋白相对表达量检测 用剩余磨牙牙髓粉末，经裂解液裂解后提取总蛋白，并用BCA法测定蛋白浓度，计算上样量。取蛋白，上样、电泳后转膜，并用5%脱脂牛奶封闭1 h，分别加入兔抗大鼠NELL-1、Notch、Delta-1抗体一抗(均按1∶2 000稀释)，4℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(按1∶4 000稀释)，室温孵育2 h，TBST洗膜3次，加入ECL化学反应液，曝光显影后，以GAPDH为内参，目的蛋白条带灰度值/内参灰度值之比即为目的蛋白相对表达量。

2 结果

2.1 痛行为学比较 与对照组比较，模型组擦面行为时间增加(P<0.05)；与模型组、NELL-1-NC组比较，NELL-1组擦面行为时间减少(P<0.05)；与模型组、NELL-1-siRNA-NC组比较，NELL-1-siRNA组擦面行为时间增加(P<0.05)。见表1。

表1 各组幼鼠痛行为学

2.2 血清中TNF-α、IL-1β水平比较 与对照组比较，模型组TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)；与模型组、NELL-1-NC组比较，NELL-1组TNF-α、IL-1β水平均降低(P<0.05)；与模型组、NELL-1-siRNA-NC组比较，NELL-1-siRNA组TNF-α、IL-1β水平升高(P<0.05)。见表2。

表2 各组幼鼠血清TNF-α、IL-1β水平

2.3 牙髓组织病理学观察 HE染色显示：对照组幼鼠成牙本质细胞排列规律，无炎性细胞浸润及血管充血现象；模型组、NELL-1-NC组、NELL-1-siRNA-NC组大鼠成牙本质细胞层排列紊乱，有大量弥散性中性粒细胞浸润，血管充血明显；NELL-1组大鼠成牙本质细胞部分排列紊乱，有少量炎性细胞浸润，血管轻度扩张；NELL-1-siRNA组成牙本质细胞排列紊乱，大量炎性细胞浸润并聚集成团，血管扩张变形严重，管腔内有红细胞出现，有牙髓坏死现象。见图1。

注：A：对照组；B:模型组；C:NELL-1组；D:NELL-1-NC组；E:NELL-1-siRNA组；F:NELL-1-siRNA-NC组

2.4 牙髓组织中NELL-1 mRNA表达比较 与对照组比较，模型组NELL-1 mRNA表达降低(P<0.05)；与模型组、NELL-1-NC组比较，NELL-1组NELL-1 mRNA表达升高(P<0.05)；与模型组、NELL-1-siRNA-NC组比较，NELL-1-siRNA组NELL-1 mRNA表达降低(P<0.05)。见表3。

表3 各组幼鼠牙髓组织NELL-1 mRNA表达

2.5 牙髓组织NELL-1、Notch、Delta-1蛋白相对表达量比较 与对照组比较，模型组NELL-1蛋白表达降低，Notch、Delta-1蛋白表达升高(P<0.05)；与模型组、NELL-1-NC组比较，NELL-1组NELL-1蛋白表达升高，Notch、Delta-1蛋白表达降低(P<0.05)；与模型组、NELL-1-siRNA-NC组比较，NELL-1-siRNA组NELL-1蛋白相对表达降低，Notch、Delta-1蛋白表达升高(P<0.05)。见表4，图2。

表4 各组幼鼠牙髓组织NELL-1、Notch、Delta-1蛋白表达

图2 Western Blot检测各组蛋白表达情况

3 讨论

急性牙髓炎的诱发因素包括外伤、饮食习惯、口腔卫生情况差及气压骤变等，炎症发生后，若感染未及时控制，毒素可通过根尖孔引起根尖感染，严重者发展为牙髓坏死，造成不可复性损伤[10]。作为牙髓病中最常见疾病之一，急性牙髓炎通常给患者带来极大痛苦，因此寻找其治疗靶标在临床中至关重要。NELL-1蛋白具有成骨特异性强、诱导形成的骨组织更致密、炎症反应更小的特点，被证实是骨稳态和软骨内骨化的关键调节剂，其大量失活可阻碍阑尾骨骼的生成[11]。本实验通过构建NELL-1重组质粒，观察其对急性牙髓炎幼鼠牙髓损伤的修复情况，明确其作用机制，为急性牙髓炎临床治疗提供新型治疗方案。

机体自身的免疫系统可参与牙髓组织对外来有害物质的防御反应。细菌及毒性物质侵入牙髓组织后，通过免疫细胞及炎性介质等的相互作用，在激活细胞释放细胞因子以抵抗外来抗原的毒性作用的同时，会引起组织损伤，导致牙髓组织最终坏死。研究表明，NELL-1具有促进内源性细胞迁移及血管生成的作用，将其与生物材料结合使用，可有效减轻疼痛及恢复时间，降低发病率[12]。NELL-1在多种动物模型的骨诱导中发挥重要作用，可减轻LPS诱导的人牙髓细胞中的炎症反应[13]。本研究分别过表达和敲降NELL-1，分析其对牙髓炎幼鼠牙髓损伤的影响，结果显示，NELL-1过表达可明显减少擦面行为时间，降低炎症因子水平外，对牙髓组织病理也有明显的改善作用，而敲降NELL-1后上述结果则呈相反趋势，提示过表达NELL-1可缓解疼痛反应，减轻炎症反应，利于牙髓损伤恢复。上调NELL-1可影响相关信号通路，保护人二尖瓣间质细胞免受TNF-α诱导的炎性损伤[14]。由此推测，NELL-1可能通过某种机制发挥抑炎作用，从而改善幼鼠牙髓损伤。

Notch信号通路由受体、配体及细胞内效应器分子组成，不仅影响细胞正常形态，还通过与相邻细胞间相互作用，调节细胞、组织、器官的分化发育[15-16]。

动物实验表明[17-18]，大鼠牙髓损伤后，牙髓细胞中Notch信号被激活，并呈动态表达，相关药物可能通过调节Notch相关途径增强牙髓干细胞向成骨细胞或成牙本质细胞的分化，在抗炎的同时，诱导修复性牙本质形成。Delta-1作为Notch通路配体，可显著增强体外牙髓干细胞的增殖、分化[19]。通过调节Notch相关途径，可影响牙髓干细胞和根尖乳头干细胞分化和增殖过程[20]。本研究进一步探讨NELL-1改善牙髓损伤的作用机制，结果显示，过表达NELL-1后，随着NELL-1 mRNA和蛋白表达明显升高，而Notch蛋白及Delta-1蛋白表达明显降低，敲降NELL-1后则与上述结果趋势相反，提示NELL-1可能参与调节Notch通路关键分子的表达，其抗炎作用可能与抑制Notch相关通路有关。

综上所述，过表达NELL-1可以减轻急性牙髓炎幼鼠炎症反应，改善牙髓病理变化，从而达到损伤修复的目的，其机制可能与抑制Notch相关通路有关，可为临床急性牙髓炎的靶向治疗提供方案。

利益相关声明：所有作者声明无利益冲突。

作者贡献说明：武珂对实验进行了构思和设计，姜新亚和陈颖进行了实验操作过程，张雪进行数据整理、收集及分析，武珂撰写并修订论文，姜新亚、陈颖和张雪审校论文。