药食两用柳叶蜡梅叶不同茶制品质量评价

汪雯欣，程科军，金 叶

（1.丽水学院生态学院，浙江 丽水 323000；2.丽水市农林科学研究院，浙江 丽水 323000）

柳叶蜡梅（Chimonanthus salicifoliusS.Y.Hu）为蜡梅科（Calycanthaceae）蜡梅属（Chimonanthus Lindley）半常绿灌木，在浙江、江西及安徽等省份均有分布[1-3]。柳叶蜡梅叶作为畲药“食凉茶”的植物来源收载于《浙江省中药炮制规范》[4]。早在北宋年间，畲民就有使用食凉茶治疗和预防感冒的习惯，距今已有近千年应用历史。食凉茶在畲药中的使用最为广泛、影响最大，被誉为“畲药第一味”[5]。食凉茶具有祛风解表、清热解毒、理气健脾、消导止泻等功效，临床主要用于治疗因感受风寒引起的肚痛、肚胀、腹泻，或因饮食不当而引起的消化不良、腹部胀痛等症。国家卫计委于2014年批准了柳叶蜡梅为新食品原料[6]，使其在食品方面的深加工研发与后续营销有了法律许可，更为柳叶蜡梅的规模化种植、工业化生产和深加工开发开辟了广阔的发展空间。柳叶蜡梅早年的食用仅为晾干的原植物叶，并未经任何复杂工艺制作，存在外观松散、质脆易断等缺点。2008年以来，丽水市农林科学研究院研制开发了柳叶蜡梅叶的绿茶制品，其采用珠茶加工方式，通过摊放、杀青、揉捻、初烘、复揉、滚干做形等工序制作而成[7-8]。柳叶蜡梅绿茶（珠茶）外形颗粒圆紧、色泽绿润、香高持久、经久耐泡，冲泡后汤色碧绿明亮。

目前，国内外学者对柳叶蜡梅的研究主要集中在种属分类[9]、人工栽种[10-11]、化学成分[12-18]、生物活性[19-21]、简单分离提取工艺[22-24]和质量标准[25-26]等方面。但上述报道中涉及的材料来源均为原植物叶，未见柳叶蜡梅叶茶制品化学成分的相关报道。本研究以规范化种植基地的柳叶蜡梅绿茶和红茶制品为研究对象，建立指纹图谱的同时测定柳叶蜡梅茶制品中芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚的含量，对比分析绿茶和红茶加工工艺对指标成分的影响，以期为全面评价柳叶蜡梅茶制品的产品质量提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 1260高效液相色谱仪（配有DAD检测器），美国安捷伦科技公司生产。对照品芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司，质量分数均大于98%。色谱纯甲醇和乙腈购自北京百灵威科技有限公司。其他试剂为分析纯，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 柳叶蜡梅绿茶和红茶样品

柳叶蜡梅绿茶和红茶由丽水市农林科学研究院制备，鲜叶来源均为浙江省衢州市开化县。绿茶（珠茶）制备工艺：4月下旬至5月采摘一芽一叶或者一芽二叶，长度6 cm以内的鲜叶，经摊放、杀青、揉捻、解块、干燥等工序制作珠茶，具体加工技术参见报道[7]。柳叶蜡梅红茶制作工艺：柳叶蜡梅鲜叶在室内萎凋至鲜叶含水率60%左右，轻压揉捻成条，发酵4 h（30℃，相对湿度95%），初烘30 min（120℃），足干90 min（90℃）。将10批柳叶蜡梅绿茶和红茶样品依次编号为S1～S10，样品信息见表1。水分含量测定采用2020年版《中国药典》四部的烘干法。

表1 柳叶蜡梅绿茶和红茶样品

2 方法与结果

2.1 样品制备

2.1.1 对照品溶液制备

分别取所需对照品适量，精密称定，70%甲醇溶解后制成芦丁0.60 mg/mL、异槲皮苷0.66 mg/mL、山柰酚-3-O-芸香糖苷2.0 mg/mL、槲皮苷0.55 mg/mL、槲皮素0.59 mg/mL、山柰酚0.52 mg/mL的混合对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备

分别取柳叶蜡梅红茶和柳叶蜡梅绿茶样品约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%甲醇25 mL，密塞，称定质量，30℃以下超声处理40 min，放冷至室温，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液。

2.2 色谱条件

Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相为乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脱程序：0～25 min，A（5%→15%）；＞25～45 min，A（15%→20%）；＞45～90 min，A（20%→50%）；流速0.8 mL/min；进样量20 μL；柱温35℃；检测波长360 nm。

2.3 方法学考察

2.3.1 指纹图谱方法学

精密度试验：制备S1供试品溶液，按“2.2”项色谱条件连续进样6次，以峰形对称且响应值大的10号峰（山柰酚-3-O-芸香糖苷）为参照峰，用于计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值。结果表明：指纹图谱相似度均大于0.99，共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于1.39%，仪器精密度良好。

稳定性试验：制备S1供试品溶液，分别于0、4、8、12、16、24、32、48 h进样。结果表明：指纹图谱相似度均大于0.96，共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于1.51%，供试品溶液在48 h内稳定。

重复性试验：平行制备6份S1供试品溶液，进样分析。结果表明：指纹图谱相似度均大于0.94，共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于1.54%，方法重复性良好。

2.3.2 定量分析方法学

线性和检出限：精密吸取混合对照品溶液，稀释至不同浓度，按“2.2”项色谱条件进样分析。以各对照品进样浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线。将已知质量浓度样品的信号与噪声信号进行比较，以信噪比为3∶1时的质量浓度确定检出限。

精密度：取混合对照品溶液，连续进样6次，各指标成分的峰面积RSD值均小于0.27%。重复性：平行制备6份S5供试品溶液，各指标成分的峰面积RSD值均小于1.88%。稳定性：制备S5供试品溶液，分别在0、4、8、12、16、24、32、48 h测定，各指标成分的峰面积RSD值均小于1.78%。

加样回收率：取S5供试品溶液9份（3份/组，各指标成分含量已知），每组样品分别精密加入0.5、1.0和1.5倍已知含量的对照品溶液。加样回收结果显示：各指标成分的回收率在96.12%～103.2%之间，RSD值均小于1.97%。定量分析方法学考察结果见表2。

表2 液相色谱法方法学参数和标准曲线

2.4 指纹图谱建立和相似度评价

取柳叶蜡梅绿茶和红茶样品（S1～S10），分别按“2.1.2”项方法制备供试品溶液，按“2.2”项方法采集指纹图谱（见图1）。在“中药色谱指纹图谱相似度价系统”（2012版）中采用平均数法生成柳叶蜡梅绿茶和红茶的对照指纹图谱。柳叶蜡梅红茶样品的指纹图谱共标定18个共有峰（占总峰面积90%以上）。根据对照品比对、加样回收试验和参考文献［27-28］，指认6、8、10、11、15和17号峰分别为芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚。柳叶蜡梅绿茶样品的指数图谱共标定16个共有峰（占总峰面积90%以上），除槲皮素和山柰酚未检出外，其他共有峰与红茶一致。柳叶蜡梅红茶和绿茶的对照指纹图谱以及混合对照品色谱图中的色谱峰指认结果如图2所示。

图1 柳叶蜡梅绿茶和红茶指纹图谱

图2 混合对照品色谱图（A）及柳叶蜡梅红茶（B）和绿茶（C）的对照指纹图谱

柳叶蜡梅绿茶和红茶的指纹图谱相似度计算结果表明：柳叶蜡梅红茶（S5～S10）之间的相似度大于0.984，因此2021年5—10月制备的柳叶蜡梅红茶样品质量没有明显差异。柳叶蜡梅绿茶（S1～S4）的相似度大于0.987。然而不同年份的绿茶样品中芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷和指标成分总量等峰面积数据存在逐年下降的情况，可见“中药色谱指纹图谱相似度价系统”中使用的夹角余弦算法对绿茶样品之间的色谱数据差异不够敏感。此外，柳叶蜡梅绿茶和红茶的指纹图谱相似度均低于0.507，因此柳叶蜡梅绿茶和红茶虽原料相同，但两种茶的制作方式不一，使得两种茶的化学成分种类和含量有较大区别。

2.5 指标成分含量测定

柳叶蜡梅绿茶和红茶样品中芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚的含量测定结果见表3。柳叶蜡梅绿茶的黄酮类化合物中，山柰酚-3-O-芸香糖苷含量最高（占总峰面积的44%），槲皮素和山柰酚则未检测出。2018年至2021年制备的柳叶蜡梅绿茶中上述黄酮类成分总量逐年下降。2018年制备的绿茶样品中黄酮类成分总量仅为2021年绿茶样品的51%，可见存放年限对绿茶质量影响较大。

图1、图2和表3结果显示：柳叶蜡梅绿茶中未被检出的槲皮素和山柰酚在柳叶蜡梅红茶中含量较高。6种指标成分中，芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷和槲皮苷为黄酮醇苷类化合物，而槲皮素和山柰酚则为黄酮醇类化合物。在红茶制作过程中，黄酮醇苷在热和酶的作用下发生水解，脱去糖苷类配基生成黄酮醇，在一定程度上减少了黄酮苷类物质的苦味。作为柳叶蜡梅绿茶中含量最高的黄酮醇苷——山柰酚-3-O-芸香糖苷在红茶制作过程中发生水解，脱去芸香糖，生成山柰酚。因此，在柳叶蜡梅红茶中，黄酮醇类结构的山柰酚和槲皮素含量最高（占总峰面积的49%），且黄酮类成分总量远低于柳叶蜡梅绿茶。

表3 柳叶蜡梅绿茶（S1～S4）和柳叶蜡梅红茶（S5～S10）中6种指标成分含量测定结果 单位：mg/g

3 讨论

柳叶蜡梅是畲族习用药材，也是浙西南人民使用广泛的药食两用植物，民间主要使用晒干的原植物叶，其缺点是质脆易断、不易保存，不利于食凉茶的市场推广。近年来，丽水市农林科学研究院采用绿茶加工方式将柳叶蜡梅嫩芽叶制作成精制食凉茶，所制绿茶（珠茶）汤色碧绿，具有桉油精的特殊清香，口感清爽、略苦涩。此外，本研究首次制备柳叶蜡梅红茶，所制红茶冲泡后汤色红且明亮，桉油精的特殊气味基本消失，滋味较醇，苦涩感较绿茶明显降低。

本研究首次构建了柳叶蜡梅不同茶制品的液相指纹图谱，方法简单、重复性好。红茶和绿茶样品分别标记出18个和16个共有峰，色谱峰相对保留时间和相对峰面积RSD值均低于1.54%。柳叶蜡梅红茶中检测出6种黄酮类成分，包括芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷、槲皮苷、槲皮素和山柰酚；绿茶样品以黄酮醇苷类成分为主，指标成分包括芦丁、异槲皮苷、山柰酚-3-O-芸香糖苷和槲皮苷，未检出槲皮素和山柰酚。红茶和绿茶样品中，上述指标成分峰面积占共有峰面积的82%和83%，基本能够代表红茶和绿茶化合物信息。此外，柳叶蜡梅红茶和绿茶的指纹图谱相似度低于0.507，可见不同茶制品由于生产工艺不同，其化学成分种类存在明显差异。

2021年不同时间制备的6批红茶样品相似度大于0.984，质量相对稳定。2018—2021年的绿茶样品随保存时间增加，指标成分峰面积出现规律性下降，但不同年份的绿茶样品相似度仍大于0.987。相似度计算结果无法体现绿茶质量变化的主要原因在于：色谱指纹图谱相似度计算一般采用夹角余弦法，该算法主要从整体上表达指纹图谱的平均相似程度，对浓度变化不够敏感、对图谱间的细微差异分辨能力不足[29]。因此，指纹图谱无法完整体现柳叶蜡梅茶制品随保存时间发生的质量变化，需要结合指标成分含量测定方法控制其质量。后续的含量测定结果表明：随着保存时间增加，绿茶样品中含量较高的芦丁、山柰酚-3-O-芸香糖苷含量和4种指标成分总量出现规律下降。尤其是保存一年后的2020年绿茶样品，黄酮类成分含量较2021年绿茶样品大幅度下降。柳叶蜡梅红茶样品中黄酮类成分总量仅为绿茶样品的18%～39%；以山柰酚-3-O-芸香糖苷为代表的黄酮醇苷，在红茶制作过程中大量水解成山柰酚等黄酮醇类化合物。

目前关于柳叶蜡梅茶制品的质量研究未见报道，而柳叶蜡梅叶作为一种可再生的药食两用植物资源，具有很大的药用和食用潜力，可以进行深入研究。本研究所建立的液相指纹图谱和含量测定方法不仅可以为柳叶蜡梅茶制品的质量控制提供依据，也初步确定了柳叶蜡梅茶制品质量控制的指标性成分，进而为其药效物质基础研究奠定基础。