血清中相关细胞因子表达水平变化对肺结核治疗效果的评估

李华 许婉华 龚兰 谢贝 杨瑜 刘志辉 吴玲孟繁荣 王楠 王琪 张言斌

1广州市胸科医院肺部疾病研究所（广州 510095）；2广州市结核病防治所二分所（广州 510095）；3广州市红十字会医院（广州 510220）

目前，结核病仍然是非洲和东南亚等落后地区人类的十大死因之一，结核病治疗效果的评估主要依赖于症状好转、痰菌转阴、病灶吸收。对于症状不明显或痰菌阴性的患者，治疗效果的评估主要依赖于病灶吸收。然而病灶吸收过程漫长，且不易观察，不能做到及时指导临床医生调整治疗方案。若能从机体抗结核免疫反应的微观层面来评估结核病情是否得到控制及好转，或许可提高抗结核治疗效果评估的灵敏度及准确度。结核发病过程中的免疫反应主要由巨噬细胞、T 细胞等免疫细胞及其表达分泌的细胞因子介导［1］。血清中细胞因子可由多种细胞共同产生，同时细胞因子对免疫细胞的免疫活性具有一定的调节作用［2］。结核病活动期间血清中多种细胞因子表达水平升高，治疗后降低［3］，说明细胞因子在结核病的发生发展过程中起了重要作用。肺结核治疗过程中伴随着结核的控制及病情好转，患者血清中细胞因子表达水平也会出现相应变化，这种变化或许可以一定程度上反应抗痨治疗的效果，然而鲜有这方面的报道。因此本研究试图通过监测56 位肺结核患者治疗前及强化期结束后血清中细胞因子的表达水平及其变化，分析细胞因子在治疗效果评估方面的潜力，进而为其在指导临床医生治疗方案调整方面的应用提供科学依据。

1 资料与方法

1.1 纳排标准 选择2021年1-4月在广州市胸科医院就诊的临床确诊为肺结核的患者。排除标准：（1）既往结核病史或耐药结核病；（2）肺部其它疾病；（3）其它感染性疾病；（4）自身免疫性疾病（如HIV，类风湿关节炎、强直性脊柱炎、哮喘、干燥综合征、系统性红斑狼疮、硬皮病、多发性肌炎以及皮肌炎等；（5）近三个月内服用免疫抑制剂，激素类药物；（6）肝肾等脏器存在器质性病变、血液病、恶性肿瘤等；（7）妊娠期或哺乳期妇女；（8）临床资料不完整者。本研究符合医学伦理学标准，并经本院伦理委员会批准。

1.2 样本收集和保存 所有受试者在治疗前及强化期治疗2月后，均拍肺部X 线胸片，并抽取静脉血3 mL，置于抗凝管中，静置1 h 后，2 000 r/min 离心20 min，分装血清于冻存管中，-80 ℃保存。

1.3 血清中细胞因子浓度测定 血清解冻后离心取上清。流式细胞管中加入细胞因子联合检测试剂盒（免疫荧光法，赛基生物）中的捕获微球混合液25 μL，标品管中加入梯度稀释的标品25 μL，样本管中加入血清25 μL。所有管中加入25 μL荧光检测试剂，涡旋混匀，室温避光孵育2.5 h。反应结束加入1 mL PBS，200g离心5 min 后，弃掉上清，加入200 μL PBS。样品按照标准品管、样品管的顺序上流式细胞仪（BD，FACSAriaTMⅡ）检测，利用试剂盒自带软件做标准曲线，并分析血清中的白细胞介素（IL）-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12 P70、IL-17、肿瘤坏死因子（TNF）-α、干扰素（IFN）-γ 和IFN-α 的浓度，见图1。

图1 样本收集、保存及分析流程图Fig.1 Flow diagram of sample collection，storage and analysis

1.4 数据处理 （1）分组：将病例治疗2月时胸片显示的病灶情况与治疗前相比，病灶无变化或变大的患者归为无效组，病灶吸收的患者归为有效组。（2）Ratio 值：治疗2月时血清中各细胞因子浓度与治疗前浓度的比值。（3）阳性：对于单个细胞因子来说，Ratio 值大于该细胞因子的界值认为治疗无效，即为阳性。对于串联组合：若组合内所有细胞因子的Ratio 值均大于其界值则为阳性；否则为阴性。并联组合：若组合内有一个细胞因子的Ratio 值大于其界值，则为阳性；否则为阴性。

1.5 统计学方法 采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析，计量结果用M（P25，P75）表示；组间比较采用非参数Mann-Whitney 秩和检验；P＜0.05为差异有统计学意义。依据受试者工作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC）探索Ratio 值的界值及检验效能。

2 结果

2.1 一般临床资料比较 以肺结核患者治疗2月后胸片好转认为有效，其它认为无效。入组患者青少年和中老年的比为1.5∶1；男女性别比为2.1∶1。无效组和有效组在年龄结构和性别分布方面均无差异，见表1。

表1 56 例肺结核患者基本资料Tab.1 Clinicopathological characteristics of 56 patients with pulmonary tuberculosis 例（%）

2.2 12 种细胞因子血清表达水平变化分析 肺结核患者治疗前及治疗2 个月后，12 种细胞因子血清表达水平见表2。总体而言肺结核患者治疗两月后血清中IL-6、IFN-γ表达水平较治疗前降低，差异具有统计学意义（P= 0.020、0.023），IL-10 表达水平较治疗前升高，差异具有统计学意义（P=0.011）。有效组治疗两月后血清中IL-6 表达水平较治疗前降低，差异具有统计学意义（P= 0.033），但无效组治疗前后IL-6 表达水平无变化。

表2 肺结核治疗2月后12 种细胞因子血清表达水平变化分析Tab.2 Analysis of serum expression levels of 12 cytokines after 2 months of pulmonary tuberculosis treatment M（P25，P75）

2.3 12 种细胞因子Ratio 值在肺结核治疗效果评估中的检验效能 12 种细胞因子Ratio 值及其检验效能见表3。

表3 12 种细胞因子Ratio 值对肺结核治疗有效性评估的检验效能分析Tab.3 Analysis of the diagnostic performance of 12 cytokines Ratio for evaluating the efficacy of pulmonary tuberculosis therapeutic efficacy M（P25，P75）

2.4 细胞因子组合在肺结核治疗效果评估中的检验效能 为了进一步提高细胞因子对肺结核治疗效果评估的检验效能，将以上12 种细胞因子进行串联或并联组合，计算其检验效能。检验效能较好的组合及其检验效能见表4。

表4 细胞因子串联组合对肺结核治疗有效性评估的检验效能分析Tab.4 Analysis of the diagnostic performance of series combination of cytokines for evaluating the efficacy of pulmonary tuberculosis therapeutic efficacy

3 讨论

肺结核发病过程中，血清中多种与抗结核免疫反应相关的细胞因子浓度升高，其中包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ、IL-17、IL-1β、IL-12和IL-8 等［4-10］。肺结核早期，血清中TNF-α 水平升高，其可刺激IL-18、IL-1β 等细胞因子和黏附因子的分泌，调控细胞激活和黏附，参与肉芽肿形成，从而在结核感染中起保护作用［11-12］。然而过多的TNF-α 分泌却会导致组织坏死、空洞形成［13］。IL-1β 由单核巨噬细胞产生，可促进空洞形成，增强巨噬细胞杀菌作用。此外，研究表明，肺结核患者血清中细胞因子的表达水平与疾病严重程度息息相关，如有研究发现肺结核患者血清中IFN-γ、TNF-α、IL-6 和TGF-β1 浓度与细菌负荷直接相关，而TNF-α、IL-1β、IL-6 和TGF-β1 浓度与放射学严重程度相关［14］。对肺结核患者血清中TNF-α、IL-1β、IL-6 等细胞因子表达水平的监测则可作为判断治疗效果的指标，治疗过程中以上细胞因子的迅速回复预示着更好的预后［15］。结核患者血清中IL-2 和IFN-γ 水平可用于区分结核的活动性［16］。总之，肺结核患者血清细胞因子表达水平的检测有助于了解肺结核的活动性，监测抗结核治疗的效果，判断病情及预后［10，17-19］。

为了评估细胞因子在监测抗结核治疗效果方面的作用，本研究分析了56例肺结核患者治疗前和治疗2 个月后血清中部分细胞因子表达水平的变化。就总体而言，肺结核患者治疗2个月后，血清中IL-6和IFN-γ的浓度均降低（IL-6中位数从4.66 pg/mL降到3.54 pg/mL，降幅达24%；IFN-γ中位数从1.97 pg/mL降到1.47 pg/mL，降幅达25%），而血清IL-10 浓度轻微升高（中位数从1.66 pg/mL 升高到1.75 pg/mL，增幅仅有5%）。IL-6 由巨噬细胞和T 淋巴细胞等分泌，高表达会引发机体高烧、不适和体重减轻等症状［20-22］。多篇研究均表明，结核患者血清中IL-6和IFN-γ 浓度显著高于潜伏感染者或健康对照者，且其浓度与结核病的严重程度密切相关［23-24］。本研究发现治疗2 个月后，肺结核患者血清中IL-6 的降低幅度较大，可能与治疗过程中，患者病情的好转有关。IL-10 是一种抗炎因子，可抑制巨噬细胞和树突状细胞的免疫功能，有助于控制和启动免疫反应［25］，过量产生则会导致感染的失控［26］。而治疗结束时高水平的IL-10 可能是结核病复发的危险因素［27-28］。本研究中，肺结核患者治疗2 个月后，血清IL-10 浓度轻微上升，推测治疗2 个月时，大部分肺结核患者体内还处于一种炎症状态，即IL-10 对抗结核治疗的效应较IL-6 慢。

为了研究细胞因子浓度的变化与治疗效果之间的关系，将患者按其治疗2 个月期间影像学病灶有无缩小分类后（无变化归入无效组），发现有效组中，肺结核患者治疗2个月后，只有IL-6血清浓度降低（IL-6 中位数从5.71 pg/mL 降到4.17 pg/mL，降幅达27%）。进一步说明IL-6 有用于抗结核治疗效果监测的潜力。

为了排除细胞因子表达水平的个体差异，计算治疗2 个月时血清中各细胞因子浓度与治疗前浓度的比值，即Ratio 值，并分析了其用于评估肺结核治疗效果的检验效能。TNF、IL-17、IL-1β 的Ratio值在判断肺结核治疗无效时的敏感度为100%，但特异度较低；IL-4、IL-6、IFN-γ、IL-12P70、IFN-α、IL-8 的Ratio 值在判断肺结核治疗无效时的敏感度＞80%，但特异度较低；IL-5 和IL-10 的Ratio值在判断肺结核治疗无效时的特异度＞80%，但敏感度较低。以上研究结果说明，单独一种细胞因子在评估抗结核治疗效果方面的检验效能较差。

本研究分析了多种细胞因子串联或并联组合在评估抗结核治疗效果方面的检验效能，发现IFN-γ、IL-17 和IFN-α 三种细胞因子串联组合后，在诊断肺结核治疗无效时的灵敏度84.00%，特异度70.97%，准确度76.79%；IL-6 和IFN-α 两种细胞因子串联组合后，在诊断肺结核治疗无效时的灵敏度80.00%，特异度67.74%，准确度73.21%。可见同时监测肺结核患者血清中多种细胞因子浓度变化，可一定程度上反应抗结核治疗效果。

总之，以上研究表明肺结核患者血清中多种细胞因子浓度变化在监测抗结核治疗效果方面具有一定的潜力，但是本研究只表征了肺结核治疗2月后的细胞因子浓度变化趋势。因此，未来该方向的研究重点应放在抗结核治疗更早期血清中相关细胞因子浓度变化与治疗效果关系的探寻上。