红景天苷和顺铂对SKOV3细胞增殖作用比较研究

2022-10-18莫荣纤杨思静白生菊巩转娣

西北民族大学学报（自然科学版） 2022年3期

莫荣纤，许娟，杨思静，赵岩，白生菊，巩转娣

(1.西北民族大学生命科学与工程学院，甘肃兰州 730030；2.西北民族大学医院，甘肃兰州 730030)

卵巢癌指生长在卵巢上的恶性肿瘤，大多数为卵巢原发性癌，少部分为继发性肿瘤，而在卵巢恶性肿瘤中以上皮癌最为多见[1].因其缺乏早期症状，患者就诊时往往已达晚期.在晚期治疗中以铂类药物作基础化疗最为多见，但其疗效不佳且毒副作用大.近年来，研究者对中药研究越来越关注，其中有学者发现中药红景天提取物红景天苷具有降血脂、降血糖，提高体力、脑力、记忆力[2]、注意力和免疫力的功效.另外还有抗衰老[3]、抗氧化[4]、抗肿瘤、抗肺纤维化、抗动脉粥样硬化、抗炎镇痛[5]，神经保护[6]、改善骨质疏松等作用，而其中的抗肿瘤作用得到研究者的广泛关注.本项目旨在研究顺铂、红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3的体外增殖影响，分析比较两药物对SKOV3增殖的影响，为进一步开发中药抗肿瘤、抑癌制剂提供思路.

1 实验材料

人卵巢癌细胞SKOV3(上海酶研生物科技有限公司)；红景天苷(成都瑞芬思生物科技有限公司)；顺铂(西安昊轩生物科技有限公司)；McCoy’s 5A培养基(上海酶研生物科技有限公司)；青霉素-链霉素溶液、胎牛血清、DMSO(北京索莱宝科技有限公司)；含EDTA胰蛋白酶(上海英潍捷基贸易有限公司)；Cell Counting Kit-8细胞增殖毒性检测试剂盒(北京北仁化学科技有限公司)；PBS缓冲液干粉(Coolaber公司).

2 实验方法

2.1 SKOV3细胞复苏、培养及冻存

细胞复苏：加热去离子水，解冻SKOV3细胞，待细胞液融化后用移液枪吸取细胞液转移至离心管中，2 500 r/min，离心5 min取出.弃去上清液，加入培养液将沉淀细胞团吹打混匀，后转移至培养瓶中，放入37 ℃、5%CO2培养箱中做基本的增殖培养.

细胞培养：用15%胎牛血清、85%McCoy’s 5A培养基、0.1%青霉素-链霉素溶液配成培养液，用5 mL/瓶的量培养SKOV3细胞，两天一次换液.当细胞增殖到对数期时进行胰蛋白酶消化传代或转板做给药实验.

细胞冻存：血清按DMSO=9∶1配制冻存液，置于4 ℃备用.每瓶细胞冻存1管，每管1 mL冻存液.细胞做常规胰酶消化后立即加入培养液终止消化，此过程需操作迅速，防止细胞消化过度.用巴氏管吹散细胞团，将细胞悬液转移至离心管，2 500 r/min，离心5 min(以能在离心管底部看到白色细胞沉淀为准.)弃上清液，加入冻存液吹打混匀转移至冻存管.给予细胞冻存管梯度温度环境适应，最后转移到液氮罐中保存.

2.2 实验分组与处理

实验设置红景天苷组、顺铂组、对照组(见表1所示)，其中每个组药物浓度设置5个复孔.

表1 顺铂和红景天苷浓度及实验分组

将培养瓶中培养至对数期的SKOV3细胞进行胰酶消化后转移至九十六孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，共30个细胞悬液孔.另设置无细胞空白组即100 μL培养液.将培养板放入培养箱中培养，当细胞贴壁生长量达90%以上时即可进行加药培养24 h、48 h、72 h.CCK-8检测前，弃去旧培养液，每孔依次先后加入90 μL培养液和10 μLCCK-8溶液，轻摇混匀，放入培养箱孵育2 h取出在酶标仪450 nm下测定各孔板的吸光度值(OD值)，计算药物对细胞增殖的抑制率.药物抑制率(%)=[OD(对照)-OD(加药)]/[OD(对照)-OD(空白)]×100%.运用浓度-抑制率回归直线方程计算每个时间段的半抑制浓度(IC50)，以及使用金正均法则公式q=E(A+B)/(EA+EB-EA×EA)计算顺铂与红景天苷联合用药的效应评价.公式中E(A+B)为A、B两种药物联合作用细胞的抑制率，EA为A药物单独作用细胞的抑制率，EB为B药物单独作用细胞的抑制率.

2.3 顺铂和红景天苷对SKOV3细胞抑制作用

严格按照CCK-8试剂盒说明书检测SKOV3细胞抑制率.待培养瓶内的细胞长至90%时，胰酶消化用血球计数板计数，稀释细胞悬液至2×104/mL，铺于96孔板，每孔加100 μL的细胞悬液，剩余6孔加基础培养液作为空白孔.铺板时枪头置于96孔板的孔壁，将悬液沿着孔壁缓缓打下去，每铺12个孔后细胞悬液进行吹打混匀.96孔板不可晃动直至铺板结束.将板轻轻移至培养箱，静止15 min，观察细胞数量及均匀程度，培养箱培养过夜.次日显微镜观察，细胞贴壁状态良好，细胞数量铺于90%左右时各孔加不同浓度的红景天苷，每个浓度设置5个复孔，做好标记.分别在24 h、48 h和72 h时间后，每孔加10 μL CCK-8溶液，置于培养箱温育3 h，用多功能酶标仪测定450 nm处的吸光度(OD)值，计算不同浓度红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3增值的抑制率，计算公式为:

增值抑制率：[(Ac-As)/(Ac-Ab)]*100%;细胞存活率：[(As-Ab)/(Ac-Ab)]*100%.

As：实验孔(药物、CCK-8、含有细胞的培养基)；Ac：对照孔(CCK-8、含有细胞的培养基，不加药物)；Ab：空白孔(不含细胞的培养基、CCK-8，不加药物).

2.4 SKOV3细胞增殖线性回归

根据CCK-8所得抑制率求线性回归方程.根据方程式计算红景天苷作用于卵巢癌细胞SKOV3的半数抑制浓度.

2.5 SKOV3细胞的半数抑制浓度

半数抑制浓度(IC50)是药物抑制50%细胞所需要浓度.根据线性回归方程计算红景天苷作用于SKOV3细胞24 h、48 h和72 h时的半数抑制浓度.应用SPSS v.21.0回归分析概率，选择置信限度0.5的概率相对应的估算来验证回归方程的计算结果.

2.6 数据处理

实验数据采用SPSS 21.0软件进行统计分析.实验数据的图表采用Graphpad prism8软件进行制作.

3 结果

3.1 SKOV3细胞增殖能力的影响

3.1.1 顺铂组

顺铂对卵巢癌细胞SKOV3抑制率随着浓度的增加逐渐升高(图1).顺铂作用SKOV3细胞24 h时，CIS-2组的抑制率显著高于CG组和CIS-1(P<0.05)，CIS-3、CIS-4和CIS-5组抑制率极显著高于CG组和CIS-1组(P<0.01)，CIS-1组与CG组间无显著性差异；作用48 h时，CIS-1组和CIS-2组显著高于CG组(P<0.05)，CIS-3组显著高于CIS-1组(P<0.05)，CIS-4和CIS-5组极显著高于CG组和CIS-1组(P<0.01)；作用72 h时，CIS-1组显著高于CG组(P<0.05)，CIS-2组显著高于CIS-1组(P<0.05)，CIS-2组极显著高于CG组(P<0.01);CIS-3、CIS-4和CIS-5组极显著高于CG组和CIS-1(P<0.01).结果表明，顺铂对卵巢癌细胞SKOV3增值的抑制作用呈剂量依赖性.

与CG组比较*P<0.05；与CIS-1组比较##P<0.01

3.1.2 红景天苷组

红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3的抑制率随着浓度增加逐渐升高(图2).分别在24 h、48 h和72 h时，SAL-2和SAL-3实验组的抑制率显著高于CG组(P<0.05)，SAL-4和SAL-5实验组的抑制率极显著高于CG组(P<0.01)；SAL-3和SAL-4实验组的抑制率显著高于SAL-1组(P<0.05)，SAL-5实验组的抑制率极显著高于SAL-1组.各时间点SAL-1组与CG组间无显著性差异.结果表明，红景天苷对卵巢癌细胞SKOV3增值具有抑制作用，并且其抑制作用呈浓度依赖性.

与CG组比较*P<0.05；与SAL-1组比较##P<0.01

3.1.3 顺铂和红景天苷对SKOV3细胞增殖抑制率比较(见表2)

表2 顺铂和红景天苷对SKOV3细胞增殖抑制率的比较

3.2 顺铂和红景天苷对SKOV3细胞的半数抑制浓度

3.2.1 顺铂作用于SKOV3细胞的半数抑制浓度

图3所示，随着作用时间延长，顺铂的半数抑制浓度依次下降，48 h和72 h的半数抑制浓度极显著地低于24 h(P<0.01)，72 h的半数抑制浓度极显著低于48 h.结果显示，顺铂作用于SKOV3细胞的半数抑制浓度呈时间依赖性逐渐下降.

与24 h组比较*P<0.05；与48 h组比较##P<0.01

3.3.2 红景天苷对SKOV3细胞的半数抑制浓度

随着24 h、48 h和72 h时间延长，红景天苷的半数抑制浓度依次下降(图4).48 h的半数抑制浓度显著低于24 h(P<0.05)，72 h的半数抑制浓度极显著低于24 h(P<0.01).结果显示，红景天苷作用于SKOV3细胞的半数抑制浓度具有时间依赖性.

48h组与24 h组比较*P<0.05；72 h组与24 h组比较##P<0.01

3.3 顺铂、红景天苷与SKOV3细胞增值能力的线性关系

3.3.1 顺铂组

顺铂作用于卵巢癌细胞SKOV3 24 h、48 h和72 h的线性回归曲线如图5所示.

图5 顺铂作用于SKOV3细胞的线性回归

3.3.2 红景天苷组

红景天苷作用于卵巢癌细胞SKOV3 24 h、48 h和72 h的线性回归曲线如图6所示.

图6 红景天苷作用于SKOV3细胞的线性回归

3.3.3 顺铂和红景天苷对SKOV3细胞增值的线性关系

表3 顺铂和红景天苷与SKOV3细胞增值能力的线性关系比较

4 分析与讨论

卵巢癌的90%～95%为卵巢原发性癌.De Waal Y.R等[7]研究发现，所有卵巢恶性肿瘤的15%中胃肠道是原发性肿瘤的最可能位置，其次是乳房和内膜.尽管卵巢癌发病率低于宫颈癌和子宫内膜癌而居妇科恶性肿瘤第三位，但因早期缺乏显著临床症状，患者就诊时大多数已到晚期，使得死亡率高居妇科癌症首位，是严重威胁妇女健康的最大疾患.大部分患者晚期治疗中通过铂类药物[8]进行联合基础化疗.本研究的顺铂药物通过损伤癌细胞DNA[9-10]来诱导细胞凋亡.近期有研究表明，VDAC1[11]可以增加顺铂对靶点的敏感性.尽管如此，但患者在化疗阶段仍承受着药物毒副作用带来的巨大痛苦[12]，因此在当今研究中为寻求疗效高且不良反应小的抗肿瘤药物具有极其重要的意义.有研究者提出，在化疗阶段实行中西医[13]结合，通过中药治疗卵巢癌具有多靶点、多途径、毒副作用小[14]等特点来降低化疗给患者带来的痛苦，此治疗方向已成为国内外学者的研究热点.在现有研究里已有瑞香素[15]、番茄红素[16]、龙胆苦甙[17]、大蒜素[18]、二氢青蒿素联合卡铂[19-20]等中药对卵巢癌细胞增殖有一定的抑制作用，还会诱导卵巢癌细胞程序性死亡.本研究中的红景天苷属红景天植物的苷类提取物[21]，可用于治疗糖尿病、高血压、冠心病、代谢紊乱等.在抗肿瘤方面，红景天苷通过阻滞细胞周期[22]、诱导细胞自噬和凋亡[23]等手段来抑制多种人类癌细胞株的生长.在现有研究中，红景天苷对舌鳞状细胞癌[24]、肺癌细胞[25]、宫颈癌细胞[26]等均有一定程度的抑制增殖与诱导其凋亡作用，红景天苷对炎症反应下的子宫内膜上皮细胞也具有抗炎和保护作用[27].

本研究通过采用CCK-8方法检测由不同浓度顺铂、红景天苷处理SKOV3细胞经24 h、48 h和72 h后，顺铂、红景天苷对SKOV3细胞增殖影响进行对比分析.实验结果表明，顺铂、红景天苷对SKOV3细胞增值的抑制作用均呈浓度和作用时间的依赖性，即抑制率与药物浓度呈线性关系，两组药物的总体抑制效果相似.两组药物对SKOV3细胞的抑制率与空白组比较差异极显著(P<0.01).小浓度顺铂作用SKOV3细胞增殖的抑制效果即可接近成倍浓度的红景天苷的抑制效果，即顺铂对SKOV3细胞的抑制效果显著高于红景天苷.两药物组的IC50均与药物作用SKOV3细胞时间呈依懒性，顺铂和红景天苷经48 h和72 h的半数抑制浓度极显著地低于24 h(P<0.01)，经72 h的半数抑制浓度极显著低于48 h.

综合上述，中药红景天苷对卵巢癌临床应用提供了新的实验基础，为进一步研发抗肿瘤中药治疗药物提供一定的依据.但本研究还存在诸多不足，还未对红景天苷的药理学、毒理学以及体内用药效果进行分析，未对红景天苷作用SKOV3细胞后凋亡和周期测定.未来应进一步从卵巢癌裸鼠建模体内对红景天苷药物毒性进行更加精确的细胞分子机制方面的深度研究.