铜绿假单胞菌寡核苷酸酶的纯化、结晶和活性验证

张建羽,张琼林

（南开大学生命科学学院生物化学与分子生物学系，天津 300071）

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa）属于条件致病菌，是导致院内感染的主要原因之一［1-2］，囊性纤维化、艾滋病、器官移植、烧伤和尿毒症等免疫力低下的人群较易被该菌感染［3］。由于该菌的天然内在耐药性，后天获得性耐药性和适应性耐药性复杂交织，使临床治疗面临巨大的挑战，已被世界卫生组织列入多重耐药（multidrug-resistant，MDR）致病菌［4-5］。

3′，5′-环二鸟苷［Bis-（3′-5′）cyclic diguanylic acid，c-di-GMP］是细菌的第二信使，能够感应胞外信号，通过升高或降低其在胞内的水平，调控胞内相关酶活性，调节细菌行为和多种表型，如运动性、毒力、致病性、抗生素产生、生物膜形成、细胞形态、细胞周期控制和细胞通讯等［6-7］。在P.aeruginosa中，二鸟苷酸环化酶催化三磷酸鸟苷（guanosinetriphosphate，GTP）合成c-di-GMP，磷酸二酯酶A将c-di-GMP线性化为中间产物二鸟苷磷 酸 ［5′-phosphoguanylyl-（3′，5′）-guanosine，pGpG］，下一步由磷酸二酯酶B（phosplodiesterase-B，PDE-B） 降解为鸟苷单磷酸 （guanosinc monophosphate，GMP）， 而 寡 核 苷 酸 酶（oligorbonuclese，Orn）是PDE-B的主要来源［8-9］。由此可见，Orn是胞内c-di-GMP代谢通路中的关键酶。研究［10-11］显示：低水平c-di-GMP能够启动细菌的三型分泌系统致使宿主表现出急性感染症状，而高水平启动六型分泌系统致使宿主表现出慢性感染症状。目前，铜绿假单胞菌寡核苷酸酶（P.aeruginoseOrn，PaOrn）的三维结构尚未见报道。本研究通过表达纯化PaOrn蛋白、蛋白晶体筛选和酶活性实验，探讨该蛋白与P.aeruginosa毒性的关系，为药物靶点开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 菌株、主要试剂和仪器

pET 32M3C质粒基于pET32a载体改造，将thrombin酶切位点替换为PreScission Protease酶切位点。大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli）DH5α菌株购自大连TaKaRa公司，E.coliBL21（DE3）菌株购自北京博迈德公司。质粒提取试剂盒购自北京康为世纪生物科技有限公司，PCR试剂盒购自北京全式金生物技术股份有限公司，LB培养基、琼脂、琼脂糖、氯化钠（NaCl）、咪唑和硫酸镍等购自生工生物工程（上海）股份有限公司，GelRed购自美国Biotium公司，结晶试剂购自美国Hampton Research公司。AKTA纯化系统购自美国通用公司，核酸电泳仪、凝胶成像仪和电泳仪购自美国伯乐公司。

1.2 PaOrn生物信息学预测和分析

通过http：//web.expasy.org/protparam/平台对PaOrn蛋白质序列进行基本理化性质分析，包括相对分子质量、氨基酸总数、理论等电点和稳定性推测等，为电泳结果分析、分子筛选和纯化工艺提供指导。通过http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/平台分析氨基酸序列是否含信号肽，若含信号肽需截去；通过http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/服务器分析跨膜区；通过http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi网址分析蛋白结构相似性，若蛋白结构相似度高于30%，可采用分子置换方法解析结构，若低于30%可采用同晶置换和多波长反常散射［12］等方法。

1.3 pET 32M3C-PaOrn重组质粒构建

Orn在P.aeruginosa基因组中编号为PA4951，以P.aeruginosa为扩增模板，通过PCR获得Orn基因片段，采用限制性内切酶BamHⅠ和EcoRⅠ处理Orn片段和质粒pET 32M3C，使基因片段和载体暴露黏性末端，通过T4连接酶将其连接，最后得到pET 32M3C-PaOrn重组质粒；以pET 32M3CPaOrn为模板，PCR定点突变Orn基因，从而获得pET 32M3C-PaOrnD11A、pET 32M3C-PaOrnE13A、pET 32M3C-PaOrnD111A、pET 32M3C-PaOrnH157A和pET 32M3C-PaOrnD162A点突变重组质粒。最终以测序结果为准，将测序正确的重组质粒通过热激法分别转入DH5α和BL21（DE3）中，用于质粒扩增和基因表达。

1.4 Orn的表达和纯化

将菌种以1%（V/V）接种于液体培养基（氨苄青霉素抗性），200 r·min－1、37℃过夜培养。活化后的菌种仍按1%（V/V）接种于液体LB培养基，200 r·min－1、37℃培养4 h。低温16℃诱导表达，诱导剂IPTG终浓度0.3 mol·L－1，诱导培养16 h。4 000 r·min－1离 心20 min收 集 菌 体，使用20 mol·L－1Tris和150 mol·L－1NaCl（pH 8.0）缓冲液重悬。重悬菌液采用高压匀浆破碎仪850 MPa、4℃破碎菌液，破碎液4℃、18 000 r·min－1离心45 min后取上清液冰浴。①Ni亲和层析：目标蛋白的组氨酸（histidine，His）标签可与Ni填料结合，蛋白液以2 mL·min－1流速与Ni色谱柱结合，使用平衡缓冲液洗去非特异性结合，向层析柱中加入0.2 mg PreScission Protease蛋白酶，取下Ni色谱柱4℃保持48 h；使用平衡缓冲液冲洗Ni色谱柱，PaOrn和PreScission Protease蛋白酶被冲洗去除，融合标签保留于Ni色谱柱上。②GST亲和层析：酶切引入PreScission Protease蛋白酶带有GST标签，可经GST亲和层析去除。采用20 mmol·L－1Tris（pH 8.0）缓冲液冲洗GST色谱柱，样品溶液缓慢滴加至重力层析柱，同时收集穿透液。③阴离子交换层析：采用20 mmol·L－1Tris（pH 8.0）缓冲液冲洗色谱柱，将GST层析的洗脱液以2 mL·min－1流速上样，平衡缓冲液洗去非特异性结合，缓冲 液20 mmol·L－1Tris和1 mol·L－1NaCl（pH 8.0），以0%～50%、90 min的线性梯度洗脱，收集1.2 mL洗脱液，根据收集管内聚丙烯酰胺凝胶结果收集样品。使用超滤浓缩管浓缩样品并将PaOrn蛋白置换至20 mmol·L－1Tris（pH 8.0）缓冲液中，－80℃条件下保存。

1.5 晶体条件筛选

采用商业化结晶试剂和坐滴法筛选晶体。初筛试剂各取100 μL，对应加入至48孔结晶板中。PaOrn样品配制为5和10 g·L－1工作浓度，分别取1 μL滴入结晶孔，池液1 μL悬滴于样品上，胶带密封结晶板。结晶板置于16℃恒温室静置，3 d后采用倒置显微镜观察结晶情况。PaOrn晶体与GMP以1∶3摩 尔 比 共 同 孵 育，PaOrnD11A晶 体 与pGpG以1∶3的摩尔比共同孵育，16℃孵育3 d。

1.6 尿素聚丙烯酰胺（Urea-PAGE）法验证PaOrn活性

PaOrn水解10 nt RNA产物经Urea-PAGE法鉴定［13］。分 别 配 制0.1 mmol·L－110 nt RNA和0.13 mmol·L－1PaOrn蛋白，稀释液均为20 mmol·L－1Tris、100 mmol·L－1NaCl和2 mmol·L－1二氯化锰（MnCl2），pH 8.0，冰浴。将0.1 mmol·L－110 nt RNA（36 μL）和0.13 mmol·L－1PaOrn溶液置于37℃水浴中预热5 min，向预热的底物中加入1.8 μL PaOrn，迅速斡旋混匀，分别在如下反应时间取样4 μL：0、2、4、6、8、10和20 min。迅速取样，并立即加入甲酰胺缓冲液，95℃加热5 min，冰浴5 min，13 000 g离心10 min，取同体积的上清液上样。采用300 V电压预电泳3 min，然后 电压调至220 V运行40 min。取出胶片，去离子水清洗3遍，GelRed［14］染 色15 s，立 即 取 出 并 采 用ChemiDocMP成像系统拍照。

1.7 高分辨质谱法验证蛋白活性

配 制0.01 mmol·L－1pGpG和0.13 mmol·L－1PaOrn蛋 白，稀 释 液 均 为20 mmol·L－1Tris，pH 8.0。取40 μL pGpG溶液，放入37℃水浴中预热5 min，向 其 中 加 入0.13 mmol·L－1PaOrn溶液1.12 μL，反 应8 s后 立 刻98℃加 热10 min，18 000 g离心10 min，取25 μL上清液进行高分辨质谱Q TOF［15］定性分析，采用MassLynx软件分析数据，验证PaOrn蛋白活性。

2 结 果

2.1 PaOrn生物信息学分析

PaOrn相对分子质量为20 826，由180个氨基酸组成，理论等电点为5.48，摩尔吸光系数ε为1.349 g·L－1，PaOrn亲水指数为－0.494，属于亲水性蛋白。PaOrn无信号肽，无需修改氨基酸残基序列，见图1 A。PaOrn不含跨膜区，非膜蛋白，可选择常规纯化和结晶，见图1 B。PaOrn是3′，5′核酸外切酶超家族核酸外切酶家族（Psp-Glu-Asp-His，DEDDh）的一员，成员拥有相似的结构域，见图1 C。PaOrn与霍乱弧菌寡核苷酸酶VcOrn（PDB ID∶6N6A）［16］有71.59%同源性。

图1 PaOrn的生物信息学分析Fig.1 Bioinformatic analysis of PaOrn

2.2 PaOrn的表达和纯化

2.2.1 Ni亲和层析PaOrn携带硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）标签（相对分子质量12 000）、His标签和连接肽（相对分子质量为2 590），PaOrn相对分子质量为20 826，故重组蛋白相对分子质量为35 416。目的蛋白有明显的胞内可溶表达，并且表达量可观，见图2。按照咪唑浓度梯度洗脱，流速4 mL·min－1，设置洗脱线性梯度0%～60%缓冲液B（20 mmol·L－1Tris，150 mmol·L－1NaCl，500 mmol·L－1咪 唑），洗 脱90 min。泳 道1～7为洗脱峰。收集洗脱峰，收集液中加入PreScission™Protease蛋白酶切标签，混合均匀置于4℃环境中，酶切16 h。见图3。

图2 SDS-PAGE分析PaOrn蛋白表达电泳图Fig.2 Electrophoregram of expression of PaOrn analyzed with SDS-PAGE

图3 PaOrn的Ni亲和层析Fig.3 Ni affinity purification of PaOrn

2.2.2 GST亲和层析 低温酶切后，大多数标签被切下，以满足下一步纯化需求。经GST纯化后，去除残留的PreScission™Protease蛋白酶。收集GST层析后的洗脱液，使用透析袋去除蛋白样品中的盐类，最终透析至20 mmol·L－1Tris pH 8.0缓冲液中。在透析10 h内无蛋白降解，蛋白稳定性好。见图4。

图4 PaOrn的GST亲和层析Fig.4 GST affinity purification of PaOrn

2.2.3 阴离子交换层析 阴离子交换层析图中，主峰（3E12～4A2）和杂质峰（4A2～4D3）能够实现良好分离。在主峰前半段，即3E12～3F10，有相对分子质量较大的杂质；在主峰后半段，即3F10～4A2，纯度较高，在电泳图上无杂质条带，可用于结晶。杂质峰中降解物比例偏高。见图5。

图5 PaOrn的Q阴离子交换层析Fig.5 Q anion exchange purification of PaOrn

阴离子交换洗脱液因含高浓度盐溶液，故需通过超滤浓缩的方式浓缩并置换缓冲液，最终浓缩至20 mmol·L－1Tris（pH 8.0）中，浓度为20 g·L－1。浓缩后蛋白纯度高，可用于结晶，见图6。浓缩物分装冷冻保存，避免反复冻融。

图6 PaOrn浓缩物的SDS-PAGE分析Fig.6 SDS-PAGE analysis of PaOrn concentration

2.3 PaOrn结晶条件筛选及优化

初筛时，PaOrn可于多种条件下出现晶体，如WizardⅠ#18、WizardⅢ#4、WizardⅣ#20、WizardⅡ#48、Index #62、PEG/IonⅡ#29和PEG/IonⅡ#33等。经X射线衍射验证，均无法用于解析蛋白结构。于WizardⅠ#12：1.0 mol·L－1（NH4）2HPO4、0.1 mol·L－1Imidazole、pH 8.0条件下出现形状规则的晶体。经衍射，该晶体的分辨率 为1.85，PaOrn-GMP和PaOrnD11A-pGpG复 合物的分辨率分别为1.90和1.70。见图7。

图7 PaOrn及其复合物晶体图Fig.7 Photoes of crystals of PaOrn and its complexes

2.4 PaOrn核酸降解实验

因PaOrn能够降解2～5 nt RNA［17］，故本研究设计了10 nt长度的降解实验验证其是否可降解更长的底物核酸片段。在Mg2+催化下，反应20 min后，10 nt nanoRNA已被彻底水解。在Mn2+催化下，反应6 min后，10 nt nanoRNA即可被彻底水解。因此，PaOrn能够降解更长片段的寡核苷酸，且Mn2+催化效率更高。PaOrn的DEDD位点Asp11、Glu13、Asp111、His157和Asp162突变后，无法降解底物10 nt nanoRNA，表明酶活性已经丧失。见图8。

图8 Urea-PAGE法分析核酸降解Fig.8 Nucleic acid degradation analyzed by Urea-PAGE method

2.5 PaOrn降解底物的定性分析

高分辨率质谱Q TOF可精确定性，相对分子质量精确至小数点后4位。目标检测物为核酸，使用离子对试剂三乙胺和六氟异丙醇增强的分析能力［18］。由于底物pGpG昂贵，因此上样量较少，质谱基线抬高。本研究严格控制反应时间，使底物pGpG未反应完全。pGpG（Mr 707.09）可被纯化的PaOrn降解为GMP（Mr 362.05）。见图9。该结果与其他来源的Orn活性研究［19］相吻合，Orn降解pGpG为GMP。

图9 高分辨率质谱Q TOF定性分析Fig.9 Qualitative analysis by high-resolution mass spectrometry Q TOF

3 讨 论

P.aeruginosa因其条件致病性和多重耐药性使常规临床治疗效率变低或无效，目前尚无有效且长期的治疗方案，严重威胁到人类生命健康。PaOrn作为第二信使c-di-GMP代谢途径中的重要参与者，对细菌的耐药性和毒性起到关键的调节作用。

本研究经PaOrn蛋白表达、Ni亲和层析、GST亲和层析和IEX-Q阴离子交换层析多步纯化，获得高纯度PaOrn蛋白，并筛选出晶体PaOrn（1.85）、PaOrnD11A-pGpG（1.70）和PaOrn-GMP（1.90）。高分辨质谱结果显示：PaOrn能够将pGpG降 解 为GMP，在P.aeruginosa中，Orn又是降解pGpG的主要来源，因此Orn可通过调节c-di-GMP水平发挥菌体的多种生物学作用，如毒力、生物被膜形成及运动能力。与其他来源Orn序列比对，找到DEDDh位点，通过点突变实验 获 得 突 变 蛋 白 （OrnD11A、OrnE13A、OrnD111A、OrnH157A和OrnD162A），经活性验证，点突变致使酶活性完全丧失。这些保守的活性位点可组成一个偏碱性的活性口袋，推测金属阳离子可能优先进入催化区域，寡核酸底物通过金属离子的定位及路易斯酸碱作用进入活性口袋。二价金属阳离子Mn2+的催化效果要优于Mg2+，推测可能Mn2+更容易与核酸形成络合物，募集底物进入催化空间。本研究中核酸降解实验结果显示：PaOrn除能够水解天然底物pGpG和2～5 nt RNA外，还可降解长达10 nt RNA。与霍乱弧菌VcOrn（PDB ID 7V5H）、大肠杆菌EcoOrn（PDB ID 1YTA）和贝纳特氏立克次体CbuOrn（PDB ID 3TR8）等其他来源的Orn结构比较显示：活性口袋均有“三明治”夹层结构，能够较好地固定底物，可能通过His残基激活水分子传递电子，促使磷酸二酯键断裂。底物越短，越有利于其与活性口袋的结合；底物越长，越不利于口袋的捕获［20］。PaOrn可降解更长片段的底物，但由于抓取力不够，催化效率和结合力均可能会变弱。当DEDD活性位点突变时，PaOrn完全丧失催化活性，而PaOrn又是降解中间代谢产物pGpG的主要来源，若P.aeruginosa中Orn失活，则第二信使c-di-GMP水平升高。研究［21］显示：c-di-GMP水平升高会激活T6SS慢性感染系统，降低T3SS急性感染系统，推测P.aeruginosa急性毒力减弱。PaOrn与P.aeruginosa毒力之间存在密切关联，针对PaOrn晶体结构和活性的研究具有重要的意义，可为研究潜在的药物靶点提供理论依据。