lncRNA PVT1靶向调控miR-625-5p对高糖诱导心肌细胞损伤的影响及其机制

黄 岚，张洪波，庄 红

糖尿病心肌病是糖尿病的主要并发症，这也是糖尿病患者病死率高的原因之一，对患者生命健康带来严重威胁[1]。心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病的主要发病机制[2]，但其具体机制还未阐述清楚。长链非编码RNA(lncRNA)与心肌细胞氧化应激、炎症反应等过程密切相关，可加速心肌细胞凋亡，引起一系列病变发生，包括糖尿病心肌病[3-4]。浆细胞瘤转化迁移基因1(PVT1)是一种在鼠浆细胞瘤内发现的致癌lncRNA，位于染色体8q24区域，可参与多种疾病的发展[5]。有研究表明，高糖诱导的心肌细胞中PVT1呈高表达，下调PVT1可减轻高糖诱导的心肌细胞凋亡，起到保护心肌细胞的作用[6]。在线数据库预测显示，miR-625-5p是PVT1靶基因之一，miR-625-5p在血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞中表达下调，并通过靶向调控STAT3/CaMKII减轻心肌肥大[7]。但是关于miR-625-5p对高糖诱导心肌细胞损伤的研究少见报道。鉴于此，本研究主要探讨lncRNA PVT1靶向调控miR-625-5p对高糖诱导心肌细胞凋亡和炎症反应的影响。

1 材料与方法

1.1细胞与试剂 心肌H9c2细胞购自中国科学院上海细胞中心；胎牛血清、DMEM培养基、葡萄糖购自美国Sigma公司；si-NC、si-PVT1、miR-NC、miR-625-5p、anti-miR-NC、anti-miR-625-5p及相关引物均购自上海吉玛生物科技有限公司；Lipofectamine 2000试剂盒、TRIzol试剂盒购自美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；凋亡试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；Cleaved-caspase3抗体、Bax抗体、GAPDH抗体、HRP标记的二抗购自美国Santa Cruz公司；RIPA试剂、BCA试剂盒、ECL试剂、双荧光素酶实验检测试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司；肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒、白细胞介素-1β(IL-1β)试剂盒、白细胞介素-6(IL-6)试剂盒购自上海酶研生物科技有限公司。

1.2细胞培养与分组 使用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养心肌H9c2细胞，置于恒温培养箱内。将对数生长期H9c2细胞接种于96孔板中，当细胞融合度为70%时，弃去培养基，更换为不含胎牛血清培养基，用5.5、30.0 mmol/L葡萄糖干预48 h，分别记为NG组、HG组；按照脂质体法将si-NC、si-PVT1、miR-NC、miR-625-5p、si-PVT1+anti-miR-NC、si-PVT1+anti-miR-625-5p转染H9c2细胞，然后用30.0 mmol/L葡萄糖干预48 h，分别记为HG+si-NC组、HG+si-PVT1组、HG+miR-NC组、HG+miR-625-5p组、HG+si-PVT1+anti-miR-NC组、HG+si-PVT1+anti-miR-625-5p组。

1.3qRT-PCR检测PVT1、miR-625-5p表达量 各组H9c2细胞使用TRIzol试剂盒提取总RNA，检测其浓度和纯度后，反转录合成cDNA，以其为模板，并配置20 μl反应体系进行扩增。分别以GAPDH、U6为内参，应用2-ΔΔCt法计算PVT1、miR-625-5p表达量。PVT1正向引物：5'-CCTGGTGAAGCATCTGATGCACG-3'，反向引物：5'-GCCAGGCTTTGTGGCACACGC-3'；GAPDH正向引物：5'-CGAGAATGGGAAGCTTGTC-3'，反向引物：5'-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3'。miR-625-5p正向引物：5'-ACTCCAGCTGGGAGGGGAAAGTTCTATAG-3'，反向引物：5'-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；U6正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

1.4流式细胞术检测细胞凋亡情况 使用PBS冲洗各组H9c2细胞，结束后加400 μl缓冲液制备成细胞悬液，先后依次加入10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI试剂，混匀避光反应30 min，加100 μl缓冲液，用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。

1.5Western blot检测Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达 各组H9c2细胞加入RIPA试剂，置于冰上30 min，离心10 min取上清液，BCA法测定蛋白浓度，将上样缓冲液加热变性5 min，行SDS-PAGE凝胶分离，转膜后使用脱脂奶粉封闭90 min，加入一抗Cleaved-caspase3(1∶800)、Bax(1∶800)、GAPDH(1∶1000)稀释液4 ℃条件下孵育过夜，次日加入HRP标记的二抗(1∶5000)稀释液，室温孵育90 min，将ECL试剂滴在膜内，显色、曝光。应用Image J软件分析蛋白条带灰度值。

1.6ELISA法检测TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平 各组H9c2细胞离心结束后，取上清液按照试剂盒说明书操作步骤，分别检测上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平。

1.7双荧光素酶报告实验验证PVT1与miR-625-5p的靶向关系 通过在线数据库预测显示PVT1与miR-625-5p存在结合位点，然后扩增含miR-625-5p结合位点的PVT1序列，插入pMIR-REPORT载体，分别构建野生型、突变型PVT1序列，即WT-PVT1、MUT-PVT1。将对数期H9c2细胞接种24孔板内，待融合至70%时，将WT-PVT1、MUT-PVT1分别与miR-NC或miR-625-5p共转染至H9c2细胞，48 h后收集细胞按照双荧光素酶报告实验检测试剂盒检测其荧光素酶活性。

2 结果

2.1PVT1在高糖诱导心肌H9c2细胞中的表达 NG组PVT1表达量为1.00±0.09，HG组为4.11±0.37，HG+si-NC组为4.14±0.40，HG+si-PVT1组为2.37±0.21。与NG组比较，HG组PVT1表达量显著升高(P<0.05)；与HG+si-NC组比较，HG+si-PVT1组PVT1表达量显著降低(P<0.05)。

2.2干扰PVT1对高糖诱导心肌H9c2细胞凋亡的影响 与NG组比较，HG组Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达及凋亡率显著升高(P<0.05)；与HG+si-NC组比较，HG+si-PVT1组Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达及凋亡率显著降低(P<0.05)。见表1、图1和2。

表1 干扰PVT1对高糖诱导心肌H9c2细胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达及凋亡率的影响

2.3干扰PVT1对高糖诱导心肌H9c2细胞炎症反应的影响 与NG组比较，HG组TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平显著升高(P<0.05)；与HG+si-NC组比较，HG+si-PVT1组TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平显著降低(P<0.05)。见表2。

表2 干扰PVT1对高糖诱导心肌H9c2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平的影响

2.4PVT1靶向调控miR-625-5p分析 在线数据库预测显示，PVT1与miR-625-5p存在互补的结合位点。见图3。双荧光素酶报告实验显示，与miR-NC组比较，miR-625-5p组MUT-PVT1荧光素酶活性差异无统计学意义(P>0.05)，WT-PVT1荧光素酶活性显著降低(P<0.05)。见表3。NG组miR-625-5p表达量为1.01±0.07，HG组为0.32±0.05，HG+si-NC组为0.33±0.04，HG+si-PVT1组为0.74±0.08。与NG组比较，HG组miR-625-5p表达量显著降低(P<0.05)；与HG+si-NC组比较，HG+si-PVT1组miR-625-5p表达量显著升高(P<0.05)。

表3 双荧光素酶报告实验结果

2.5过表达miR-625-5p对高糖诱导心肌H9c2细胞损伤的影响 与HG+miR-NC组比较，HG+miR-625-5p组miR-625-5p表达量显著升高，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白、Bax蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平显著降低(P<0.05)。见图4、表4和5。

表4 过表达miR-625-5p对高糖诱导心肌H9c2细胞Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达及凋亡率的影响

表5 过表达miR-625-5p对高糖诱导心肌H9c2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平的影响

2.6抑制miR-625-5p对干扰PVT1后高糖诱导心肌H9c2细胞损伤的影响 与HG+si-PVT1+anti-miR-NC组比较，HG+si-PVT1+anti-miR-625-5p组miR-625-5p表达量显著降低，凋亡率、Cleaved-caspase3蛋白、Bax蛋白、TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平显著升高(P<0.05)。见图5、表6和7。

表7 抑制miR-625-5p对干扰PVT1后高糖诱导心肌H9c2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平的影响

3 讨论

糖尿病是常见的代谢疾病，且大部分患者伴有心血管疾病，而糖尿病心肌病较为常见[8-9]。长期高血糖可引起心肌细胞糖脂代谢失衡，进一步促进氧化应激、炎症反应的发生，进而诱导心肌细胞凋亡，可加重糖尿病心肌病的发生[10-13]。本研究结果发现，高糖诱导心肌细胞后，其凋亡率、TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平增加，而Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达也明显上调，与上述研究结果相似。

lncRNA在进化上高度保守，近年来研究发现，其与糖尿病心肌病发生密切相关，其中DCRF、MEG3、HOTAIR等已被证实，并有望成为糖尿病心肌病的潜在治疗靶点[14-15]。还有研究发现，糖尿病心肌病患者血清TINCR低表达，上调TINCR可明显抑制高糖诱导的心肌细胞凋亡[16]。有研究结果显示，HOTAIR在糖尿病心肌组织和血清中低表达，上调HOTAIR可通过激活PI3K/Akt信号通路改善糖尿病心肌病进展[17]。高糖诱导心肌细胞后KCNQ1OT1高表达，并可通过调控miR-181a-5p/PDCD4轴减轻高糖诱导的心肌细胞凋亡和炎症反应[18]。PVT1在心脏毒性、心肌缺血再灌注损伤中高表达，可通过调控miR-187-3p或miR-214-3p促进疾病发展[19-20]。本研究结果显示，高糖诱导心肌H9c2细胞后PVT1表达量增加，干扰PVT1可降低高糖诱导心肌H9c2细胞TNF-α、IL-1β、IL-6表达水平及凋亡率，并下调Cleaved-caspase3、Bax蛋白表达，提示干扰PVT1能减轻高糖诱导心肌H9c2细胞的损伤。

PVT1可通过调控下游miRNA参与心肌细胞凋亡、炎症反应等过程，进而加快疾病发展[21-22]。本研究结果发现，PVT1与miR-625-5p存在相互结合的位点，双荧光素酶报告实验显示，过表达miR-625-5p可降低WT-PVT1荧光素酶活性，但对MUT-PVT1荧光素酶活性无影响，再次证明PVT1可靶向调控miR-625-5p表达。miR-625-5p在多种疾病中差异表达，如脂多糖刺激人支气管上皮细胞miR-625-5p表达上调，并通过靶向AKT2减轻脂多糖诱导的人支气管上皮细胞炎症反应[23]。有研究显示，在构建体外急性肺损伤模型中miR-625-5p表达上调，miR-625-5p可通过激活NF-κB信号通路减轻急性肺损伤的肺部炎症反应[24]。但是在小儿哮喘中miR-625-5p低表达，可通过调控CBL/ESR1表达减轻尘螨诱导的炎症反应[25]。先前研究显示，miR-625-5p在心肌肥大患者中低表达[7]，但是对糖尿病心肌病未知。本研究发现，高糖诱导心肌H9c2细胞后miR-625-5p表达量降低，干扰PVT1可增加miR-625-5p表达量，提示PVT1靶向负调控miR-625-5p，且过表达miR-625-5p可抑制高糖诱导心肌H9c2细胞的凋亡和炎症反应。进一步研究结果显示，抑制miR-625-5p可逆转干扰PVT1对高糖诱导心肌H9c2细胞凋亡和炎症反应的影响，提示PVT1可靶向负调控miR-625-5p减轻高糖诱导心肌H9c2细胞损伤。

综上所述，干扰PVT1可减轻高糖诱导心肌H9c2细胞的凋亡和炎症反应，与负调控miR-625-5p表达有关。