细丝蛋白B在钙化性主动脉瓣疾病中的表达及其临床意义

马名嘉 石娟 刘立刚 魏翔 青莹

主动脉瓣膜钙化随着年龄增长而逐渐加重，最终会引发瓣膜关闭不全和(或)狭窄，导致心力衰竭、心肌梗塞。瓣膜长期受血流冲击以及细胞老化凋亡影响，瓣膜内大量分布的瓣膜间质细胞(valvular intestinal cells，VICs)发生促纤维化和促成骨过程，在病理条件下，引起瓣膜钙化[1]，其发生发展受到物理因素和代谢分子调控影响，目前仍无有效预防方法，终末期治疗手段是人工瓣膜置换[2]。细丝蛋白B(filamin B,FLNB)是一种肌动蛋白结合蛋白，作为细胞骨架和多功能信号支架，参与细胞凋亡等病理进程。FLNB在各组织中广泛表达，既往研究聚焦于FLNB突变对骨骼系统发病的影响,它也有可能参与主动脉瓣钙化进程。我们对人钙化心脏瓣膜中FLNB的表达进行分析。

对象与方法

一、对象

2021年8月～2022年1月我院手术中切除的钙化主动脉瓣9例(钙化组)，女性4例，男性5例。同期因主动脉夹层手术切除的外观正常的主动脉瓣8例作为对照组，钙化组病人年龄偏大(见表1)。钙化性主动脉瓣疾病的诊断标准：心脏彩超检查提示瓣膜钙化，术中探查发现主动脉瓣有明显钙化结节，直径超过1 mm。排除感染性心内膜炎、风湿性心脏病以及结缔组织病等疾病。所有病人均签署知情同意书。

表1 两组病人一般资料比较

二、方法

1.组织样本处理：将主动脉瓣组织经福尔马林溶液充分固定后脱水、包埋并切片。另一部分剪碎为米粒大小在液氮中处理后保存于-80 ℃。

2.茜素红染色：组织切片用2%茜素红S染色液按标准染色流程染色封片，后于正置显微镜下观察并拍照。

3.免疫组织化学(IHC)SP法染色:采用IHC检测主动脉瓣中FLNB的表达及其亚细胞定位。按照标准流程进行免疫组化染色，即利用柠檬酸盐进行抗原修复，并经3%的过氧化氢和8%羊血清室温封闭非特异性抗原，随后加入FLNB特异性一抗(1∶100稀释)4 ℃下孵育过夜，次日用PBS洗涤3次，用二抗孵育60 分钟，滴加显色液，显微镜下观察控制显色时间，苏木素复染，二甲苯透明后封片。对每张切片在高倍镜下任取5个区域采集图像，染色区域取平均光密度值进行比较。

4.蛋白质免疫印迹(Western Blot):进一步应用Western Blot检测FLNB蛋白表达水平。按文献[3]，将主动脉瓣组织在液氮中研磨碎，加入裂解液，于冰浴中静置裂解，用超声破碎仪进一步破碎，取上清。使用BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。通过SDS-PAGE凝胶电泳分离后转至PVDF膜。然后抗体封闭，FLNB一抗(1∶1 000稀释)4 ℃孵育过夜。次日用TBST洗膜，孵育二抗，室温反应30分钟，洗膜。用ECL显色，在凝胶成像系统中检测蛋白信号。

三、统计学分析

结果

1.茜素红染色结果见图1A、B。主动脉钙化组切片可见瓣膜组织层次不清，明显增生融合，浅红色组织纹理间有散在深红色钙化结节，对照组病人瓣膜切片经染色后为均匀浅红色质地，未见钙化结节。

2.瓣膜IHC结果见图1C、D。IHC染色可以看见，FLNB在钙化组及对照组切片中均有表达，大部分位于瓣膜组织VICs细胞质中。钙化组平均光密度定量为(6.57±1.65)%，对照组为(0.91±0.52)%。钙化组主动脉瓣组织中FLNB蛋白表达量明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。

A 正常瓣膜未见钙化结节(茜素红染色×400)；B 钙化瓣膜有散在暗红色钙化结节(茜素红染色×400)；C正常瓣膜少量细丝蛋白B显色(SP×400)；D钙化瓣膜细丝蛋白B表达明显,亚细胞定位于细胞质内，蓝染为细胞核(免疫组化染色×400)

3.Western Blot结果见图2。结果表明，对照组可见FLNB蛋白表达，在钙化组病人主动脉瓣中，FLNB蛋白表达水平显著升高，趋势与免疫组化一致，检测蛋白条带灰度值并计算FLNB蛋白/actin蛋白比值，得出相对定量。对照组为(0.352±0.079)，钙化组为(0.652±0.037)， 两组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图2 细丝蛋白B(FLNB)Western Blot结果

4.FLNB表达与瓣膜钙化的关系见图3。以主动脉瓣茜素红染色后钙化区域所占视野面积比例表示钙化程度。瓣膜钙化程度与FLNB的蛋白表达呈正相关，钙化程度越严重，FLNB表达水平越高，Pearson相关系数r=0.47，差异无统计学意义(P=0.07)。

图3 钙化程度与FLNB水平相关性分析

讨论

瓣膜钙化是一种活跃的生物成骨过程，在钙化的主动脉瓣中可观察到约13%骨形成[4]。主动脉瓣膜分为纤维层、海绵层和心室面三层，三层内均分布有大量VICs，整个瓣膜结构由一层瓣膜内皮细胞所包裹。在适当条件刺激下，VICs可以分化为成骨细胞，表现为碱性磷酸酶的表达增高。VICs向成纤维细胞分化，促进细胞凋亡，在其周围形成富含胶原的钙化结节，导致瓣膜组织弥漫性钙化[5]。

有研究发现，FLNB可能参与心脏瓣膜疾病的发生。Yang等[6]对一个严重骨骼畸形的家系进行全外显子测序，发现一个FLNB基因移码突变影响了FLNB二聚体结构的形成。值得注意的是，上述致病突变的携带者都同时出现心脏瓣膜病变。本研究从分子表达层面证明FLNB在心脏瓣膜组织中的表达，且主要分布于VICs细胞质当中。FLNB属于细丝蛋白家族成员之一，在细胞内以二聚体形式存在。二聚体结构的不稳定性很有可能是导致心瓣膜疾病的原因之一。

本研究通过IHC和Western Blot发现，钙化主动脉瓣组织中FLNB表达增高。FLNB可能在诸多方面对于瓣膜钙化起到促进作用。有研究发现，VICs在模拟瓣膜硬化条件下培养，与正常VICs对比，前者FLNB基因的表达量显著增高[7]。本研究结果从蛋白表达水平证实在钙化瓣膜VICs中的FLNB富集。该现象提示，作为成骨分化的重要分子，FLNB可能直接参与瓣膜钙化的病理进程。作为细胞骨架构成成分，FLNB可以介导白细胞和内皮细胞的紧密连接，导致白细胞的穿内皮迁移。白细胞在瓣膜内皮下的聚集可继发炎症反应，促进瓣膜钙化[8]。

FLNB功能缺陷会导致一系列病理生理改变。与正常细胞比较，FLNB功能缺陷的成纤维细胞显示出肌动蛋白微丝紊乱无序、迁移能力下降的现象[2]。若VICs迁移能力下降，将进一步促进瓣膜的融合、增厚。此外，功能缺陷的FLNB会影响其他信号分子。Bandaru等[9]研究发现，FLNB缺陷会增强基质金属蛋白酶-9(MMP-9)活性。MMP-9可能参与细胞外基质的纤维增生和钙化。人体内FLNB突变还会促进β-连环蛋白表达，后者在瓣膜组织中参与调控VIC成骨分化，导致瓣膜钙化[10]。

本研究样本为终末期钙化瓣膜样本，未能在主动脉瓣钙化发病早期探究FLNB的表达情况。