5个相思树种根内生细菌群落多样性特征研究

潘 辉 刘 芳 曾志浩 周丽丽 袁宗胜

（1. 闽江学院海洋研究院，福建 福州 350108；2. 福建农林大学生命科学学院，福建 福州 350002）

植物内生细菌是指生活史的一定阶段或全部阶段均生活在健康植物的各种组织和器官内部，并且与植物建立了和谐共关系的细菌[1]。内生细菌通过自身产生代谢产物或借助信号转导对宿主植物生长发育产生重要影响，主要在促进宿主植物生长、增强宿主植物抗性及提高植物修复能力等方面[2]，如Microbacterium具有促进植物生长的作用[3]，Bacillus具有良好的生防潜力[4]，Sphingomonas对植物自我修复功能[5]等。相思类树种属含羞草科（Mimosaceae）金合欢属（Acacia）的常绿乔木。研究表明，相思类树种生长迅速、萌生能力强、根系发达，耐贫瘠、盐碱和干旱，是沿海地区沙质土壤更新造林的理想树种[6]。围绕相思类树引种、栽培技术及经营管理等方面已经开展了系列研究[7-8]，关于相思树根际与内生微生物群落结构差异性及关键微生物功能的研究鲜有报道，而这些方面的研究可为充分发挥相思树种土壤改良、维持地力、水土保持功能等生态效益功能提供科学依据。本研究基于 Illumina NovaSeq 测序平台，对不同种相思树根内生细菌群落结构特征及差异性进行分析，并根据它们的分类预测内生细菌种群的功能，为揭示相思树内生功能菌株的挖掘和利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 样本采集

采样地设在中国福建省漳浦中西国有林场，该区属亚热带季风气候，地理座标为117°56′ E，24°28′ N，年平均气温21.8 ℃，年降水量1 600 mm，地形为低山丘陵，土壤为沙质页岩发育的红壤。2019年11月，分别采集厚荚相思（Acacia crassicarpa）、卷荚相思（A. cincinnata）、黑木相思（A. melanoxylon）、直 干 相 思（A. mearnsil）、马占相思（A. mangium）等树种（树龄为8～10 a）的根部样本。

样本采集：随机选取健壮植株，在距树干1 m左右的位置用铁铲挖取50～60 cm深的树根，将树根取出作为根部样本，样本采集后立即放入无菌样本袋中，24 h 内放入 -20 ℃保存。本研究共采集样本15个，每个植物种类3个重复样本，每个植物种类样本编号分别为厚荚相思的根（HJ.A）、卷荚相思的根（JJ.A）、黑木相思的根（HM.A）、直干相思的根（ZZ.A）、马占相思的根（MZ.A）。

1.2 样本基因组DNA提取及高通量测序

采用试剂盒TIANGEN Plant Genomic DNA kit并按照其说明书的步骤提取样本基因组DNA。采用琼脂糖电泳检测基因组 DNA 的浓度和纯度，将检测合格的DNA进行PCR扩增形成测序文库[9]，并将质检合格的文库在Illumina NovaSeq PE250测序平台进行16Sr RNA V5-V7区高通量测序。

1.3 分析方法

通过对测序得到的双端 Reads（PE Reads）进行拼接、过滤、除去嵌合体序列，最终得到有效数据；在对有效数据进行在 97%相似度水平下的聚类后，获得分类操作单元（OTU）。采用RDP Naive Bayesian Classifier分类算法进行注释。使用BioVenn在线软件进行Venn 图绘制；使用Qiime 软件计算观测物种数、丰富度指数、香农指数等，分析不同种相思树根内生细菌群落结构特征及差异[10-12]。

2 结果与分析

2.1 测序结果及OUT分析

经测序分析，5个相思树种的15个样本共获得1 197 357 条clean tags，各样本clean tags在69 799～86 919 之间。根据相似度在97%以上的序列聚类为一个 OTU原则进行有效OTUs统计，从图1稀释曲线可以看出，当样本测序深度达15 000条时，稀释曲线都趋于平缓，表明本次测序深度足以可靠地描述与样本相关的细菌群落。

图 1 相似度为97%水平下的稀释曲线Fig. 1 Rarefaction curves at 97% sequence similarity

图2为不同种相思树根内生细菌 OTUs Venn图。从不同样本来源来看，不同种相思树根部样本 OTU 数目表现为直干相思 ＞ 厚荚相思 ＞ 马占相思 ＞ 卷荚相思 ＞ 黑木相思。5种不同种相思树根部样本有365个共有OTUs，厚荚相思、卷荚相思、黑木相思、直干相思及马占相思独有的OTUs分别为282、110、100、341个及288个。

图 2 OTU数量与分布Fig. 2 OTU distribution and Venn graphs

2.2 根内生细菌多样性分析

由表1可知，不同种相思树根内生细菌数量排序分别为：直干相思 ＞ 厚荚相思 ＞ 马占相思 ＞卷荚相思 ＞ 黑木相思；不同种相思树根内生细菌多样性排序分别为：直干相思 ＞ 厚荚相思 ＞ 马占相思 ＞ 卷荚相思 ＞ 黑木相思。由此可知，不同种相思树根内生细菌的丰富度和多样性的差异较大，直干相思根内生细菌的丰富度和多样性最高。

表 1 不同种相思树根内生细菌多样性和物种丰富度Table 1 Diversity and relative abundance of endophytic bacterial community in root of Acacia species

2.3 细菌群落结构分析

比较了纲水平上的根内生细菌群落的相对丰度，如图3a所示，在纲水平占据主导地位的主要包括Alphaproteobacteria、Gammaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria。在厚荚相思、卷荚相思的根内生细菌中Alphaproteobacteria占主导地位，其次为Gammaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria；黑木相思和直干相思的根内生细菌中Alphaproteobacteria占主导地位，其次为Unidentified_Actinobacteria和Gammaproteobacteria；而马占相思的根内生细菌中，则以Gammaproteobacteria为主导地位，其次为Alphaproteobacteria和Unidentified_Actinobacteria。在纲水平，不同种相思树根内生细菌群落结构存在差异。

在目水平上，如图3b所示，不同种相思树样本优势菌群存在较大差异。在厚荚相思、卷荚相思和直干相思的根内生细菌中Rhizobiales占主导地位，其次为unidentified_Gammaproteobacteria和Pseudonocardiales；黑木相思的根内生细菌中Rhizobiales占主导地位，其次为unidentified_Gammaproteobacteria和Frankiales；而马占相思的根内生细菌中，则以Rhizobiales、Enterobacteriales和Unidentified_Gammaproteobacteria为主导地位，不同种相思树根内生细菌群落在目水平相对丰度存在较大差异，其中马占相思树种根内生细菌群落中Enterobacteriales相对丰度最高。

在科水平上如图3c所示，5 组样本丰度前10的细菌包括Xanthobacteraceae、Beijerinckiaceae、Enterobacteriaceae、Pseudonocardiaceae、Burkholderiaceae、unidentified_Gammaproteobacteria、Pseudomonadaceae、unidentified_Acidobacteriales、Caulobacteraceae、Acidothermaceae。 通过比较不同种相思树根内生细菌群落丰度比例可知，在厚荚相思和直干相思的根内生细菌中Xanthobacteraceae占主导地位，其次为unidentified_Acidobacteriales；卷荚相思和黑木相思的根内生细菌中Xanthobacteraceae占主导地位，其次为Beijerinckiaceae；而马占相思的根内生细菌中，则以Enterobacteriaceae为主导地位，其次为Burkholderiaceae、Xanthobacteraceae、Pseudonocardiaceae、Pseudomonadaceae等。Beijerinckiaceae在卷荚相思和黑木相思细菌群落丰度比例较大；unidentified_Acidobacteriales在厚荚相思和直干相思树种中群落丰度比例较大；Enterobacteriaceae在马占相思树种中所占丰度比例最大。不同种相思树根内生细菌群落在科水平相对丰度存在较大差异。

图 3 不同种相思树根内生细菌群落的相对丰度Fig. 3 Relative abundance of endophytic bacterial community in root of Acacia species

3 结论与讨论

根部是植物的重要组织，是植物主要的营养和水份的吸收组织，内生细菌在植物组织内，依赖植物提供的有机物质和其他衍生物而存活，其活动产生的代谢产物对植物的生长也起着重要的作用。植物根的分泌物和粘液衍生的营养物质吸引了无数的有机体到根际环境中，但植物相关的细菌必须高度竞争才能成功地在根内定殖[13-16]，而不同树种根部可能存在着不同的营养吸收和分泌物的能力，可能导致了定殖在根内的细菌群落的差异性[17-22]。

本研究中发现，大部分相思树纲水平上占优势的根际细菌是Alphaproteobacteria，目水平上占优势的是Rhizobiales。这不仅表明相思树根际细菌群落的建立有一定的细菌菌群建立规律；而且Rhizobiales目的菌尤其是根瘤菌属的菌能与豆科植物共生固氮，对豆科植物及种植地土壤都有良好作用[23-24]，如根瘤菌属和慢性根瘤菌属都能从豆科植物根毛侵入根内形成根瘤，并在根瘤内成为分枝的类菌体，类菌体将分子氮还原成NH3，分泌至根瘤细胞内，并合成酰胺类或酰尿类化合物，输出根瘤，由根的传导组织运输至宿主地上部分供利用。宿主为根瘤菌提供碳源和能源以及其他必需营养，而根瘤菌则为宿主提供氮素营养[25-26]。同时根菌瘤在生活过程中可利用多种碳水化合物，并分泌相当量的胞外粘液把有机氮带到土壤中，这样就可以从环境中吸引了大量的根际微生物和生物从而大大提高了土壤的肥力[25]。这说明可通过人为选择种植相思树来“管理”土壤细菌群落，管理土壤肥力，从而改变和改善人工林的土壤养分和结构，这对人工林具有长期良好的影响。

在科水平上，厚荚相思、卷荚相思、直干相思和黑木相思的根内生细菌中优势菌为Xanthobacteraceae，该科的细菌多为无动力、氧化酶阳性的革兰阴性杆菌，主要存在于有水的环境和潮湿的环境里[11]。而在马占相思的根内生细菌中，则以Enterobacteriaceae占主导地位，该科的多数细菌有周身鞭毛，能运动，可在土壤或水中生存[11]。马占相思与其他几种相思树相比，其生长速度较快，涵养水源，木质均匀，叶蛋白质和氨基酸含量丰富。黄维南等[27]报道按每株马占相思的干叶状柄平均按26.1 kg计算，则其含有14.44 g尿囊素。尿囊素是一种脉类植物生长调节剂，可增强光合能力，提高根际微生物活性。

植物与内生细菌在长期的共同进化中已经建立了一种和谐联合的共生关系[1]。现有研究表明，植物内生细菌可以通过自身的代谢或借助于信号传导作用对植物体施加影响[2-5]。目前微生物菌剂或生物菌肥等受到人们的重视，其目标菌种多为从土壤中筛选得到，而内生菌可以从植物体表进入植物体内，并能够在植物体内定殖[28]，因此，内生细菌作为重要的微生物资源在农业生产中具有良好的研究和开发潜力。加强植物内生细菌资源的研究，加强内生细菌与植物之间生态关系的研究，以及建立各种功能内生细菌的资源库具有重要的意义。