枯草芽孢杆菌利用玉米秸秆水解液生产乙偶姻

林源，秦伟帅，王佳琳，张娜，石林，王岱杰，孟武*

1(齐鲁工业大学(山东省科学院)生物基材料与绿色造纸国家重点实验室，山东 济南，250353) 2(齐鲁工业大学(山东省科学院)生物工程学院，山东 济南，250353)3(泰山学院 生物与酿酒工程学院， 山东 泰安，271000)4(山东省分析测试中心，山东 济南，250000)

玉米秸秆作为一种天然生物质，其价格低廉、储量巨大且对环境友好，可替代木材、炭等原料制备附加值更高的新型功能材料[1]。玉米秸秆富含半纤维素、纤维素和木质素等木质纤维素[2-3]。木质纤维素作为一种极具发展潜力的环境友好型资源，在制备生物质材料、能源与化学品领域等方面引起了广泛的关注，研发出高效益和高效率的生物质水解方法可提高可再生木质纤维素生物质资源的利用和回收[4-5]。木质纤维素的预处理方法中，稀酸水解具有腐蚀性小，pH回调试剂需求量少，低成本、高工业价值和环境友好等优点，近年来一直是研究的热点[6-7]。木质纤维素被稀酸水解后，碳碳键裂开，被水解为木糖、葡萄糖、阿拉伯糖等糖类，可作为廉价原料生产生物质材料。提高木质纤维素的利用率，对生物质能源的研究具有重要意义[8]。

玉米秸秆包含了纤维素、半纤维素及木质素等纤维成分，是纯天然的优质造纸原料，玉米秸皮的纤维素含量最高，有利于提高纸浆率和纸的强度，半纤维素含量适中，有利于纸浆的吸水，易于打浆，并且经稀酸水解后的残渣中木质素含量较低，有利于蒸煮漂白，从而有利于纸张质量的提高[9]。

乙偶姻即3-羟基-2-丁酮，存在于香蕉、芒果、橘子、可可等水果中，具有特殊的奶油香味，是一种应用广泛的食品添加剂，也是一种重要的化学工业的合成原料和医药中间体，具有较高的应用价值[10]。目前，乙偶姻有酶法转换法、化学合成法和生物发酵法3种主要的生产方法[11]。其中，生物发酵法因原料获得途径较多，产品绿色天然、条件温和、环境友好等优势，应用较为广泛。而生产原料作为乙偶姻产量非常重要的一个因素，近年来对其研究甚多，木质纤维素降解物则是一种工业生产乙偶姻的理想底物，具有很大的发展前景[12]。

本研究通过响应面设计研究了稀硫酸水解时间、水解温度和硫酸浓度对玉米秸秆水解液中木糖、葡萄糖和阿拉伯糖含量的影响。在最佳水解条件下预处理玉米秸秆，并将脱毒脱色后的水解液与培养基结合，利用枯草芽孢杆菌发酵生产乙偶姻，并将水解后的秸秆残渣预处理后用于造纸，实现玉米秸秆的综合利用。

1 材料与方法

1.1 菌株与培养基

1.1.1 菌株

枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)BS2，由齐鲁工业大学(山东省科学院)生物基材料与绿色造纸国家重点实验室保存。

1.1.2 培养基

根据秸秆水解液中碳源浓度(糖含量)，以LB培养基的营养成分为标准(氮源为主)，配制发酵培养基。

LB固体培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，琼脂粉20，pH 7.2。

LB液体种子培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，pH 7.2。

发酵培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸粉5，NaCl 10，(NH4)2SO48。

1.2 实验试剂与仪器设备

硫酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；氨水、(NH4)2SO4、NaCl，国药集团化学试剂有限公司；胰蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖，上海源叶生物科技有限公司。

LC-20AD高压液相色谱仪、GC-2030气相色谱仪，日本岛津公司；MQD-B3R恒温振荡培养箱，上海旻泉仪器有限公司；BBS-SSC超净工作台，济南鑫贝西生物技术有限公司；U-6100紫外分光光度计，上海元析仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴槽，上海精宏实验设备有限公司；E200M电子显微镜，京尼康江南光学仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 原料处理和水解方法

将玉米干秸秆用粉碎机磨碎成秸秆粉末，精确称取102 g的玉米秸秆粉末(平均含水率11.8%)于高温耐压反应釜中，按照固液比1∶10(g∶mL)的比例加入不同体积分数的稀硫酸[13-14]，在不同温度下进行搅拌蒸煮(具体方案见表1)，冷水冷却后经真空过滤分离水解液和固体残渣(含纤维素、半纤维素)[15-17]。

表1 玉米秸秆的稀硫酸水解方案Table 1 Dilute sulfuric acid hydrolysis scheme of corn stoer

1.3.2 水解液处理

对稀酸水解玉米秸秆所得水解液进行脱毒脱色处理。将水解液煮沸15 min，添加氨水中和至pH=10，过滤，再滴加硫酸将pH回调至适当值，二次过滤，于25 ℃下真空蒸发浓缩至适当浓度，添加3%(质量分数)的活性炭脱色，80 ℃水浴30 min，再经抽滤后得到脱毒水解液，该方法可将水解液中的乙酸与糠醛全部除去。

1.3.3 发酵条件

菌株活化及种子液培养：用接种环取1环菌种接种到LB固体培养基中，37 ℃恒温培养18 h，挑取单菌落于50 mL LB液体种子培养基，28 ℃、200 r/min振荡培养12 h，按2%(体积分数，下同)接种量接到有50 mL LB液体种子培养基的250 mL三角瓶中，28 ℃、200 r/min振荡培养7 h，作为种子液。

摇瓶培养发酵：将种子液按6%的接种量接种到装有200 mL发酵培养基的500 mL三角瓶中，28 ℃、200 r/min振荡培养8 d，发酵过程检测各时间段的菌体生长特性和发酵表征。

发酵罐培养发酵：按6%的接种量将种子液接种到5 L自动发酵罐，装液量2 L，28 ℃、200 r/min培养8 d，发酵过程检测各时间段的菌体生长特性和发酵表征。

1.3.4 玉米秸秆水解残渣造纸方法

称取废纸箱纸片2 g，高温蒸煮后的玉米秸秆8 g。装入纤维解离器的缸内，加水至刻度线，于纤维解离器中纤维解离后，打开凯塞抄片器，安装造纸网，原料缸在纸页成型器水刻度至3时倒入，待水排出后，用滚筒压刚成型，纸张两侧用布包好后于凯塞抄片器上的真空干燥器中干燥10 min，获得纸张成品。

1.3.5 分析方法

玉米秸秆水解前后表皮及内部结构采用电子显微镜拍照对比；采用高压液相色谱仪测定木糖、葡萄糖、阿拉伯糖的含量[18]，分离柱Shodex Packed Column for HPLC(SHODO.CO.LTD)，柱温80 ℃，以水为流动相，流速1 mL/min；利用顶空-气相色谱法(headspace-GC，HS-GC)测定乙偶姻浓度，使用火焰离子化检测器，进样口检测器温度240 ℃；采用紫外分光光度计测定细胞生长的OD600值，监测细胞生长量。

1.4 数据处理与分析

以上实验均重复3次，结果以平均值±标准偏差表示，数据处理采用SPSS软件处理，制图采用Origin软件处理。

2 结果与分析

2.1 玉米秸秆酸水解的不同条件比较

2.1.1 水解条件对玉米秸秆表皮结构的影响

在不同条件下水解玉米秸秆，秸秆残渣的微观结构如图1所示，图1-a、图1-e、图1-c、图1-f显示出较高水解温度对玉米秸秆纤维的破坏较为明显，证明高温可促进水解，但温度>120 ℃时会破坏某些还原糖结构；图1-b～图1-d、图1-f显示出相同条件下，水解1 h后玉米秸杆的纤维结构变化不大，说明长时间水解不会对玉米秸秆纤维结构有太大影响；图1-d、图1-e反映出较高酸浓度的水解液也可促进水解。研究表明，较高温度和较高水解液酸浓度条件下，可能对半纤维素水解效果更好，纤维素水解更均匀，但温度和酸浓度过高反而会降解木糖、葡萄糖等还原糖[13]。

a-110 ℃,1.0%,1 h;b-110 ℃,0.8%,2 h;c-110 ℃,0.8%,3 h; d-120 ℃,0.8%,1 h;e-120 ℃,1.0%,1 h;f-120 ℃,0.8%,3 h图1 水解处理后玉米秸秆表皮结构的电子显微图Fig.1 Electron micrograph of epidermal structure of corn stoer after hydrolysis treatment

2.1.2 水解条件对水解液中还原糖含量的影响

玉米秸秆水解液通过液相色谱法测定的葡萄糖、木糖和阿拉伯糖的含量见表2。采用110 ℃水解时，各还原糖含量并不高，且水解后的秸秆干重较低高，说明较低温度不能更有效地水解玉米秸秆的木质纤维素。温度到达120 ℃时，相同条件下比110 ℃得到的还原糖更多，当用1.0%(体积分数，下同)硫酸水解处理1 h，可获得29.369 g/L木糖、14.316 g/L葡萄糖和48.631 g/L阿拉伯糖，且增加水解时间不能得到更多还原糖。

表2 水解液中各类还原糖含量Table 2 The content of arious reducing sugars in the hydrolyzate

对比本实验设计的6个水解方案所获得还原糖含量(图2)，120 ℃、1.0%硫酸水解1 h时木糖、葡萄糖和阿拉伯糖产量均最多，总还原糖量同样最多，并且水解秸秆干重也较高，说明秸秆中纤维素和半纤维素保留较好，水解残渣经脱毒脱色处理后，可以用作造纸原料，因此为最佳水解方案[19]。

图2 玉米秸秆水解液中还原糖含量对比Fig.2 Comparison of reducing sugar content in corn stoer hydrolyzate

2.2 枯草芽孢杆菌利用水解液发酵产乙偶姻

将玉米秸秆水解液与培养基结合后作为发酵培养基培养枯草芽孢杆菌，采用HS-GC测定发酵液中乙偶姻产量，如图3和图4所示。

图3 枯草芽孢杆菌利用秸秆水解液发酵的乙偶姻产量、 发酵液pH、OD600和残糖浓度Fig.3 Acetoin yield, pH of fermentation broth, OD600 and residual sugar concentration of B. subtilis using corn stoer hydrolyzate

图4 枯草芽孢杆菌利用秸秆水解液发酵生产乙偶姻 过程中糖类消耗情况Fig.4 Sugar consumption during fermentation of corn stoer hydrolyzate by B. subtilis to produce acetoin

初始pH值为5.5，发酵初期，枯草芽孢杆菌首先以发酵培养基中的葡萄糖为主要原料，随着时间延长，木糖和阿拉伯糖在葡萄糖消耗殆尽后作为主要碳源进入糖酵解过程生成丙酮酸，丙酮酸在乙酰乳酸合成酶作用下合成乙酰乳酸，乙酰乳酸继而在乙酰乳酸脱氢酶催化下合成乙偶姻。当发酵至168 h时，乙偶姻获得最高产量9.3 g/L，还原糖全部被利用，转化率为0.44 g/g。

在5 L发酵罐实验中，使用同样的发酵培养基，装液量为2 L，枯草芽孢杆菌代谢乙偶姻的发酵周期缩短，如图5，乙偶姻产量在120 h时到达最高，为10.4 g/L，转化率有所提高，为48.7%，120 h后产物产量基本不变。

图5 发酵罐中枯草芽孢杆菌利用秸秆水解液发酵的 乙偶姻产量、发酵液OD600和残糖浓度情况Fig.5 Acetoin yield，fermentation broth OD600，and residual sugar concentration fermented with corn stoer hydrolyzate by B. subtilis in a 5 L fermenter

从枯草芽孢杆菌发酵水解液生产乙偶姻的各个特征趋势来看，玉米秸秆水解液可以作为一种有效、经济的生物合成乙偶姻的原料，并且枯草芽孢杆菌可以高效利用秸秆水解液中的糖类物质，是一种可以工业生产乙偶姻的潜力菌株。

2.3 玉米秸秆水解残渣造纸研究

玉米秸秆稀酸水解后的水解残渣，经打浆、抄纸、压榨、脱水、干燥处理后易于打浆，容易漂白。如图6所示，纸张白度、匀度较好，纸浆得率较高，制成的纸张物理强度高，耐破度、耐折度良好，且外观稳定，总体性能较好，适用于纸板的制造。

图6 秸秆残渣为原料造的纸Fig.6 Paper made from straw residues

3 结论与展望

目前，生物合成乙偶姻虽然在合成途径工艺方面和工业应用等方面取得了一定成果，但想要让生物合成法成为主要方法，很大程度上取决于底物的选用，目前生物转化法所用的原料仍主要是葡萄糖，成本较高。葡萄糖、木糖和阿拉伯糖是木质纤维素生物质中含量最丰富的3种单糖，而玉米秸秆富含木质纤维素，所以玉米秸秆水解液则是一种经济、高效的优质原料。通过优化得到最优水解条件为120 ℃，1.0%硫酸水解1 h，然后通过优化菌株选育、培养方案及发酵工艺，提高乙偶姻的产率，产量到达9.3 g/L，转化率为0.44 g/g，水解残渣经处理后还可以作为原料应用到造纸工业中，实现玉米秸秆的高效利用。未来，还需进一步增强对木质纤维素化学组成成分以及水解条件影响机制等理论体系的研究，针对性地剖析影响木质纤维素降解的反应机理，为继续探寻新颖木质纤维素预处理技术提供信息支撑。