猪流行性腹泻病毒德州株的分离鉴定及ORF3基因遗传进化分析

张荣武

(山东省德州市陵城区畜牧兽医服务中心 ， 山东 德州 253000)

仔猪腹泻性疾病是猪养殖业常见的疾病，该病是导致仔猪大量死亡的主要原因之一，临床中引起仔猪腹泻的病毒性疾病主要有猪流行性腹泻(PED)、猪传染性胃肠炎(TGE)、猪轮状病毒病(PoR)等，其中PED具有导致仔猪死亡率高、病情传播快速、群发性强、难以控制的特点，是引起仔猪腹泻死亡的主要病毒性疾病[1-2]。PED是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起不同阶段猪发病的一种急性传染性疾病，该病以呕吐、水样腹泻、脱水等为主要临床特征，也称为“冬季拉稀病”，其中以哺乳猪发病率最高，死亡率高达100%，在我国猪场中广泛流行，给养猪业造成严重的经济损失[3-5]。

PEDV为单股正链RNA病毒，属于套式病毒目冠状病毒科冠状病毒属成员，该病毒基因组长28 kb，基因组中编码7个开放阅读框(Open reading frame,ORF)蛋白，主要包括5个结构蛋白和2个非结构蛋白,其中ORF3基因编码的ORF3蛋白位于S蛋白和E蛋白之间[6]。研究表明，ORF3 蛋白的缺失可以导致PEDV毒力降低或者弱化，但不影响病毒在体内的增殖与复制[7-8]。因此，对PEDVORF3 基因进行序列分析，可以间接分析该病毒株毒力的强弱，在临床中具有重要的意义。

2020年11月，本试验在德州地区养殖场中采集患腹泻仔猪的小肠组织内容物样品12份，进行PEDV分离鉴定，并对分离的PEDVORF3基因进行核苷酸序列分析，为PEDV的进一步防控及疫苗研发提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 病料来源 2020年11月，在德州地区养殖场中采集患腹泻仔猪的小肠组织内容物样品12份。

1.2 主要试剂 Vero传代细胞系，由山东农业大学兽医学院传染病实验室提供；抗PEDV S 蛋白单克隆抗体(mAb)，购自北京华研世佳质检科技有限公司；FITC标记山羊抗鼠抗体，购自北京百奥莱博科技有限公司；DL2 000 Marker、ExTaqDNA聚合酶、病毒RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、胶回收试剂盒，均购自大连TaKaRa公司；pMD-18T载体、细胞培养板、胎牛血清(FBS)、DMEM培养基、双抗，均购自美国Gibco公司。

1.3 病毒性疾病的PCR检测 参照参考文献[9-12]报道的方法，提取采集的病料组织的基因组，采用PCR/RT-PCR 方法对猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪Delta冠状病毒、猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒等病原进行检测。

1.4 病毒的分离培养和形态学观察 将PEDV检测阳性的组织加入适量的无菌PBS匀浆，-80 ℃反复冻融3～5次，12 000 r/min离心10 min，取上清过滤除菌，加入双抗处理，取病料组织上清液100 μL接种到Vero细胞中，作为感染组，同时设不攻毒的对照组，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养，每日观察细胞状态。盲传至4～5代，接毒Vero细胞出现85%的细胞病变效应(CPE)后收毒，-80 ℃低温冰箱保存备用。取出现CPE的Vero细胞进行收毒，离心取上清，用20 g/L的磷钨酸负染后，将样品送山东农业大学电镜室，通过电镜观察病毒形态。

1.5 病毒的半数组织培养感染剂量(TCID50)测定 参照参考文献[9]报道的方法，将分离的PEDV株第5代(F5)病毒用DMEM培养液做10倍倍比稀释培养，按Reed-Muench法计算TCID50。

1.6 病毒的RT-PCR鉴定 用病毒RNA提取试剂盒提取Vero细胞培养物基因组RNA，反转录为cDAN进行PCR鉴定，用PEDVM基因特异性引物(F:5′-CCTTACCCTAGACTTCAAGA-3′，R:5′-AAACCAGGGAAAAAAAGTACGA-3′)扩增，目的片段大小为370 bp。回收目的基因片段，连接到pMD-18T载体上，提取质粒进行测序。

1.7 病毒的间接免疫荧光(IFA)鉴定 参照参考文献[13-14]报道的方法，将PCR检测PEDV为阳性的F5细胞培养物上清液接种于新鲜培养的Vero细胞，作为感染组，同时设立对照组，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养24 h后进行IFA检测，于倒置荧光显微镜下观察结果。

1.8 病毒的ORF3基因扩增与序列分析 参照参考文献[9]，根据GenBank(登录号：AF353511)中PEDV基因序列，设计ORF3基因引物(F:5′-CCTAGACTTCAACCTTACGA-3′，R:5′-CCAGGAAAAAAG-AGTACGAAAA-3′)，扩增目的片段大小为774 bp。对PEDV分离株的ORF3基因进行PCR鉴定，回收目的基因片段，连接到pMD-18T载体上，提取质粒进行测序。PEDV分离株的测序结果与GenBank中登录的PEDV参考株ORF3基因序列进行同源比对，利用 DNASTAR 软件构建系统进化发育树，分析遗传变异特点。

2 结果

2.1 病毒性疾病的PCR检测 猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒、猪Delta冠状病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒的PCR检测结果均为阴性，猪流行性腹泻病毒的RT-PCR检测结果为阳性。

2.2 病毒的分离培养和形态学观察 将PEDV检测阳性样品处理后，接种于Vero细胞进行病毒分离培养，感染组的Vero细胞在盲传第5代(F5)时出现CPE，Vero细胞出现了萎缩、聚堆、脱落，个别的细胞出现肿胀、变形等(图1A)，对照组的Vero细胞未见明显的病变(图1B)。将分离的PEDV病毒株命名为德州株(JIAOZUO101)。在电子显微镜下可见，德州株(JIAOZUO101)是直径大约为100 nm的病毒粒子，具有明显的囊膜和纤突，呈典型的冠状病毒粒子形态(图2)，与刘畅等[10]报道的PEDV形态学结构基本一致。经测定德州株(JIAOZUO101)传至第5代时病毒滴度为104.6TCID50/mL。

图1 德州株(JIAOZUO101) F5的Vero细胞病变(40×)Fig.1 Vero cell lesion of Dezhou strain (JIAOZUO101) F5 (40×)A:感染组; B：对照组 A:Infected group; B:Control group

图2 德州株(JIAOZUO101)病毒粒子形态Fig.2 Morphology of virus particles of Dezhou strain (JIAOZUO101)

2.3 病毒的RT-PCR鉴定 RT-PCR鉴定结果如图3所示，德州株(JIAOZUO101)的细胞培养物扩增出大小约370 bp的目的条带，与预期大小相符。PEDV分离株测序结果与GenBank中登录的PEDV参考株同源性介于97.0%～99.9%。结果表明，经RT-PCR鉴定德州株(JIAOZUO101)为PEDV。

图3 德州株(JIAOZUO101)RT-PCR鉴定结果Fig.3 RT-PCR identification results of Dezhou strain (JIAOZUO101)M:DL2 000 DNA 相对分子质量标准； 1～2:细胞培养物； 3:空白对照M:DL2 000 DNA Marker; 1-2:Cell culture; 3:Blank control

2.4 病毒的IFA鉴定 结果如图4所示，感染组的Vero细胞呈现特异性绿色荧光，对照组未见有特异性绿色荧光。

图4 德州株(JIAOZUO101)IFA检测结果(100×)Fig.4 IFA test results of Dezhou strain (JIAOZUO101) (100×)A:感染组； B：对照组A:Infected group; B:Control group

2.5 病毒的ORF3基因扩增与序列分析 用RT-PCR方法对PEDV德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因进行扩增，结果如图5所示，德州株(JIAOZUO101)扩增出大小约为774 bp的目的条带，与预期大小相符。德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因测序结果与GenBank中登录的20株PEDV参考株ORF3基因的核苷酸序列的同源性介于 97.6%～99.9%。利用 DNASTAR软件构建系统进化发育树，并分析德州株(JIAOZUO101)ORF3基因遗传变异特点。结果如图6所示，德州株(JIAOZUO101)与Jiangxi 2017株、Henan 2015株位于同一支，遗传距离较近，其同源性介于99.3%～99.9%，与其他18株参考株的遗传距离较远。德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因序列中只是个别碱基发生变化，编码的氨基酸未发生缺失，未发生明显变异。

图5 德州株(JIAOZUO101)的ORF 3基因检测结果Fig.5 ORF 3 gene detection results of Dezhou strain (JIAOZUO101)M:DL2 000 DNA 相对分子质量标准； 1～2:细胞培养物； 3:空白对照；M:DL2 000 DNA Marker; 1-2:Cell culture; 3:Blank control

图6 德州株(JIAOZUO101)的ORF 3基因系统进化树Fig.6 Phylogenetic tree of ORF 3 gene of Dezhou strain (JIAOZUO101)▲:本试验分离毒株 ▲:Strain isolated in this study

3 讨论

PED是引起仔猪腹泻病的主要病毒性疾病之一，猪是PEDV的唯一宿主，该病对仔猪极易感，且具有发病急、传播快、死亡率高的特点，对猪具有很大的威胁[15]。国内外相关研究表明，PEDV在世界各地区广泛分布流行，在我国的多个省区也广泛流行[16-18]。PEDV侵害的部位主要在肠道，通过膜融合侵入细胞，在小肠绒毛上皮细胞中增殖与复制，引起肠道病变，同时通过粪便和分泌物排出体外，感染其他动物，仔猪的发病日龄越小，其死亡率越高[9-11]。因此，加强PED流行病学监测，对减少该病的发生与流行具有重要意义。本试验从患腹泻仔猪的小肠组织内容物样品中分离得到1株PEDV，命名为德州株(JIAOZUO101)。对该毒株的ORF3基因扩增并分析其遗传变异情况，结果显示，PEDV德州株(JIAOZUO101)的ORF3基因序列与Jiangxi 2017株、Henan 2015株同源性较近，且未发生变异情况。临床中PED的预防主要通过疫苗免疫，近几年，PEDV已经出现变异情况，导致其疫苗不能有效地保护猪群免受感染，分析PEDV是否变异，在临床为该病的流行病学及综合防控具有重要的意义[4-6]。因此，在临床中应该注重综合防控，定期免疫和消毒净化，才能有效控制PED的发生与流行。本试验为进一步的PED防控及疫苗研发提供理论参考。