基于cAMP/PKA信号通路探讨通脉养心丸对缓慢性心律失常大鼠心率的影响

蔡晓月，邓林华，李 甜，温 玉，张运娇，赵英强

(1. 天津中医药大学第二附属医院，天津 300250；2. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700；3. 天津中医药大学研究生院，天津 301617)

缓慢性心律失常是心率小于60次/min的生理反应或病理状态，因心率减慢、心排血量减少，常引起头晕、黑矇、乏力、晕厥等，严重者甚至导致恶性心血管事件直至死亡[1-2]。在我国，随着人口老龄化问题的日益突出，缓慢性心律失常的发病率也逐年上升[3]。中医根据该病的临床表现将其归属于“心悸”“怔忡”“厥证”范畴，气阴两虚证是常见证型之一[4-6]。通脉养心丸是以炙甘草汤为基础方，配合生脉散加减化裁而成，有益气养阴、通脉安神定悸之功，其中的多种中药成分有抗心律失常作用[7-12]。既往临床研究证明通脉养心丸治疗气阴两虚型心系病症有良好的疗效[13-14]，但其治疗缓慢性心律失常的机制尚不清楚。本研究通过建立缓慢性心律失常大鼠模型，基于cAMP/PKA信号通路探讨了通脉养心丸对缓慢性心律失常的干预作用及其可能机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级12周龄健康雄性SD大鼠40只，体重200～250 g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，合格证号:1100111911037746。饲养于中国医学科学院放射医学研究所清洁级动物房，每笼5只，喂养于室内通风橱内，自由取食及饮水。本实验经中国医学科学院放射医学研究所实验动物伦理委员会审批通过(IRM-DWLL-2020178)。

1.2药品 通脉养心丸(天津中新药业集团股份有限公司乐仁堂制药厂，国药准字Z12020589，规格：0.1 g/丸)，临用前用蒸馏水配制成400 g/L、200 g/L药液。盐酸普萘洛尔片(天津力生制药股份有限公司，国药准字H12020151，规格：10 mg/片)，临用前用蒸馏水配制成1.5 g/L药液。

1.3试剂与仪器 cAMP ELISA试剂盒(Bioswamp，RA20134)，PKA ELISA试剂盒(EterLife，YT003773-96T)，Trizol Reagent (Invitrogen Life Technologies，15596-026)，RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Thermo，#K1622)，三氯甲烷(国药集团化学试剂有限公司，10006818)，RIPA裂解液(武汉谷歌生物科技，货号：G2002)，磷酸化蛋白酶抑制剂(武汉谷歌生物科技，货号：G2007)，BCA蛋白定量检测试剂盒(武汉谷歌生物科技，货号：G2026)，SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(武汉谷歌生物科技，货号：G2003)，PKA antibody(EterLife，EL906252-100)，CACNA1C antibody(EterLife，EL601291-100)，Goat Anti-rabbit IgG antibody-HRP(EterLife，EL990003)，引物(Invitrogen Biotechnology Co., LTD)，信息化生物信号采集处理系统(南京美易科技有限公司，型号：MD3000-E)，紫外分光光度计(上海现科仪器有限公司，型号：752-P)，荧光定量PCR仪(ABI，Step one plus)，离心机(Heal Force，Neofuge 15R)，灰度分析软件(Alpha Innotech，alphaEaseFC)，图像分析软件(Adobe，Adobe PhotoShop)。

1.4实验方法 大鼠按照体重采用随机数字表法分成空白组、模型组、通脉养心低剂量组和通脉养心高剂量组，每组10只。空白组大鼠实验全程灌胃生理盐水；其余组大鼠按照《中药药理学》[15]提供的方法，每天上午给予盐酸普萘洛尔悬液15 mg/kg灌胃，下午模型组大鼠灌胃生理盐水，通脉养心低、高剂量组分别灌胃通脉养心丸2 g/kg和4 g/kg，给药体积均为10 mL/kg，各组均连续灌胃4周。

1.5检测指标及方法

1.5.1心率 于干预前及干预2周、干预4周后，采用异氟烷麻醉大鼠，将大鼠仰卧固定于鼠台上，连接生物信号采集处理系统MD3000-E，麻醉2 min后，待大鼠和心电图处于稳定状态时开始记录，纸速100 mm/s，连取10个心动周期，计算平均值得出大鼠心率。

1.5.2心肌组织中cAMP、PKA含量 大鼠末次灌胃后2 h，腹腔注射10%水合氯醛350 mg/kg进行麻醉,开胸腔，取心脏，生理盐水清洗血液后放入冻存管中，迅速干冰冻存，保存在-80 ℃冰箱中。取部分心肌组织，捣碎，3 000 r/min离心10 min后取上清，按照ELISA试剂盒步骤检测cAMP、PKA含量。

1.5.3心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C mRNA表达情况 采用PCR法检测：取心肌组织100 mg，研磨、冷却后，加入Trizol溶液裂解，提取RNA，用紫外分光光度计测定RNA浓度，将含2 μg RNA的溶液加入PCR管中，反转录出cDNA，以β-actin为内参，加入cAMP、PKA上下游引物，配置PCR扩增体系，反应条件：50 ℃×2 min，95 ℃×2 min，95 ℃×15 s，56 ℃×1 min，共45个循环，每个样本重复3次，用2-ΔΔCt数值来分析cAMP、PKA的mRNA 表达量。引物序列见表1。

1.5.4心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C蛋白表达情况 采用Western blot法检测：将冷TBS洗涤后的心肌组织用RIPA裂解液冰上匀浆，匀浆液冰浴30 min后12 000×g离心5 min，取总蛋白溶液。用BCA法测蛋白浓度，计算得出上样量。配制10%分离胶和4%浓缩胶液，根据蛋白定量结果加入总蛋白样品与5×蛋白质凝胶电泳上样缓冲液, 轻轻混合，95 ℃变性10 min，按顺序加完样后开始电泳，浓缩胶电压为80 V，分离胶电压为120 V，电泳后湿转法转至PVDF膜上，在摇床上封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜，TBST洗涤3次，加二抗室温孵育60 min，TBST洗涤3次后显色曝光，进行显影和定影和凝胶图像分析。

表1 大鼠心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C 引物序列及大小

2 结 果

2.1各组大鼠心率比较 干预前各组大鼠心率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。干预2周和4周后，模型组大鼠心率均明显慢于同期空白组(P均<0.05)，通脉养心低、高剂量组均明显快于同期模型组(P均<0.05)；干预2周后，通脉养心低、高剂量组大鼠心率比较差异无统计学意义(P>0.05)；干预4周后，通脉养心低、高剂量组大鼠心率与干预2周后比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，但通脉养心高剂量组大鼠心率明显快于通脉养心低剂量组(P<0.05)。见表2。

表2 空白组和缓慢性心律失常各组大鼠各时间点心率比较次/min)

2.2各组大鼠心肌组织中cAMP、PKA含量比较模型组大鼠心肌组织中cAMP、PKA含量均明显低于空白组(P均<0.05)；通脉养心低、高剂量组大鼠心肌组织中cAMP含量及通脉养心高剂量组大鼠心肌组织PKA含量均明显高于模型组(P均<0.05)，通脉养心低剂量组大鼠心肌组织中PKA含量与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)；通脉养心低、高剂量组大鼠心肌组织中cAMP、PKA含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 空白组和缓慢性心律失常各组大鼠心肌组织中cAMP、PKA含量比较

2.3各组大鼠心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C mRNA表达情况比较 模型组大鼠心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C mRNA相对表达量均明显低于空白组(P均<0.05)；通脉养心低剂量组大鼠心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C mRNA相对表达量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，通脉养心高剂量组大鼠心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C mRNA相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)。通脉养心高剂量组大鼠心肌组织中cAMP mRNA相对表达量明显高于低剂量组(P<0.05)；通脉养心低、高剂量组大鼠心肌组织中PKA、CACNA1C mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表4。

表4 空白组和缓慢性心律失常各组大鼠心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C mRNA相对表达量比较

2.4各组大鼠心组织中cAMP、PKA、CACNA1C蛋白表达情况比较 模型组大鼠心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C蛋白相对表达量均明显低于空白组(P均<0.05)；通脉养心低剂量组大鼠心肌组织中cAMP蛋白相对表达量及通脉养心高剂量组大鼠心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C 蛋白相对表达量均明显高于模型组(P均<0.05)，通脉养心低剂量组大鼠心肌组织中PKA、CACNA1C蛋白表达量与模型组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；通脉养心高剂量组大鼠心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C mRNA相对表达量与通脉养心低剂量组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1。

图1 空白组和缓慢性心律失常各组大鼠心肌组织中cAMP、PKA、CACNA1C蛋白表达情况

3 讨 论

cAMP/PKA信号通路是经典的G蛋白耦联受体介导的信号转导通路，参与和调节多种细胞活动，是调节机体离子转运的重要通路[16]。钙离子是引发心肌收缩的直接激活剂，通过细胞膜上的钙通道进入心肌细胞，影响其收缩节律[17]。正常情况下，胞内钙离子受细胞膜、肌浆网上的各种钙通道蛋白、受磷蛋白(PLB)、Ca2+-ATP酶(SERCA)、兰尼碱受体(RyR2)等多种钙结合蛋白和转运蛋白的调控，这些钙调节蛋白功能与表达的异常，导致Ca2+释放障碍,Ca2+内流减少,降低了窦房结的自律性，导致异位起搏、传导阻滞、折返等诸多心律失常的发生[18-21]。cAMP通过PKA可以磷酸化多种钙调节蛋白，调节心肌细胞内Ca2+的释放，从而影响心率[20，22-24]。钙通道是诸多钙调节蛋白之一，在细胞膜表面表达，目前有L型、T型、N型、P/Q型和R型5种类型，而L型钙通道是Ca2+流入心肌细胞的主要途径，对心律失常的影响较其他型钙通道更为显著[25-26]。L型钙通道在心肌组织主要由α1、α2、β和δ4个亚基组成，其中α1为跨膜结构，是与L型钙通道电生理学特性关系密切的功能性亚单位，编码α1亚基的基因有4种，分别是α1S、α1C、α1D、α1F，其中α1C基因是在心肌中高表达且与心脏疾病密切相关的重要通道蛋白[27]。

本实验中，模型组大鼠心率均明显慢于空白组，心肌组织中cAMP、PKA含量及cAMP、PKA、CACNA1C mRNA及蛋白表达量均明显低于空白组；通脉养心高剂量组大鼠心率均较模型组明显增快，心肌组织中cAMP、PKA含量及cAMP、PKA、CACNA1C mRNA及蛋白表达量均较模型组明显增高。提示通脉养心丸可能通过激活cAMP/PKA信号通路进而磷酸化L型钙通道而发挥提升心率的作用，且该作用与给药剂量有一定关系。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。