2021年鸡新城疫抗体水平测定国赛各环节技术分析及参赛体会

张 洁,李亚兰,潘浩浩,张青青

(甘肃农业职业技术学院,甘肃 兰州 730020)

职业技能大赛既是衡量办学质量的重要指标，也是展示师生风采的良好平台。高等职业院校通过“以赛促教、以赛促学”，不断深化教育教学改革、促进校企合作、推进产教融合，提高学生的实践技能、综合素质和创新创业能力，力求向社会输出符合市场需求的高素质人才。

现将2018年和2021年“鸡新城疫抗体水平测定”赛项考核内容对比如下表：

表1 2018年和2021年鸡新城疫抗体水平测定国赛赛项考核内容对比

2021年赛项规程较2018年加入了理论考核，更接近生产，要求学生懂得为什么这么做，对于2021年新加入的结果分析部分，规程未给出标准答案，两年的测定方法均以《新城疫诊断技术》(GB/T16550-2008)为标准。此赛项技能考核共涉及59个评分要点，操作细节决定竞赛的优劣，笔者以2021年赛项规程为例，总结参赛经验，希望能抛砖引玉，与更多同行共同探讨、互相学习。

1 试验器材准备

1.1 仪器与材料准备

1.1.1 仪器与材料 选取大赛组委会提供赛项所需材料和仪器共计34项，在参赛过程中以“使用合理的前提下够用”为原则检查清点。34项中不选择的干扰项为10 mL禽用采血器和1.5mL指型离心管两项。96孔V型血凝反应板一般4块够用，1块用于血凝试验，3块用于血凝抑制试验；5 mL禽用采血器一般1支够用，采血需一针见血；15 mL具盖塑料离心管一般2支够用，用于红细胞洗涤；进入实验室后先检查灭菌橡胶外科手套的气密性并正确佩戴，完成采血后更换手套进行后续试验操作；移液器吸取红细胞泥时采用反向移液，吸取其余液体时均采用正向移液。

1.1.2 仪器检查 微型振荡器检查,连接电源，振幅旋钮调至最小位置后打开电源，顺时针将振幅旋钮由小调大，感受振幅强度，再由最大调至最小，关闭电源，检查微型振荡器是否能正常使用。

离心机检查：开盖检查离心机内是否有套管，无异物，连接电源后设置离心机参数2 000 r/min，打开开关试转预热1～3 min，检查离心机是否能正常使用。

天平配平：以防所提供50 mL烧杯质量差异大，可粗配后再标记烧杯，在天平的配平过程中，游码应始终在标尺左端的零刻线处，将两个小烧杯口分别朝向天平外侧置于托盘中心位置，通过调节平衡螺母使天平平衡，不用时天平应处于休止状态。

1.2 物品标识

对使用物品进行如下表。

表2 物品标识注意事项

1.3 桌面整洁度

实验器材的摆放需严格区分污染区域和洁净区域，为避免相互干扰，两区域的物品在摆放完毕后尽可能不要来回挪动。

2 配制1%鸡红细胞悬液

主要考察参赛选手采血方法和采血量是否恰当、离心机使用是否规范、红细胞悬液配制方法是否得当等。

2.1 采血方法和采血量

采血过程由2位参赛者配合完成，采血时尽量做到一针见血。抓鸡要遵循“轻、稳、准、巧”的原则，鸡抓出鸡笼后，助手一手抓住鸡小腿，控制好跗关节，另一手使鸡翅扇形张开，将鸡侧卧保定于鸡笼上方，鸡胸部朝向采血者。采血者用酒精棉球由内向外顺时针或逆时针方向消毒采血部位，再用干棉球擦干，用拇指压住翅根静脉近心端至其怒张，用已吸入0.7 mL 3.8%枸橼酸钠的5 mL禽用采血器针头斜面朝上，由翼根向翅方向从血管侧面刺穿挑起皮肤后再刺入血管壁，见回血，放松近心端按压，缓慢吸取血液至3.5 mL刻线处。采血者一手用干棉球按压进针处，另一手将针管稍向后退后快速拔针，可避免血液滴出。助手按压5 min止血后将鸡放回笼中，采血者迅速盖上采血器针帽，将采血器稍向后抽，轻柔地上下混匀后置于试管架，防止血液凝固。完成采血后，助手和采血者均需更换乳胶手套。

2.2 离心机使用

仪器准备时已检查离心机可正常运转。离心管中液体最多为12 mL。调平时，离心管(包括管盖)连同离心管套一起置于已配平好的小烧杯(50 mL)中配平，然后对称放入离心机，离心参数设定2 000 r/min，离心时间和次数视红细胞洗涤情况而定，一般离心4次，前3次均离心5 min，第4次离心8 min。第1次离心后要尽量弃净白细胞层和血小板层。每次吸取完白细胞层和血小板层，加入生理盐水后均需摇匀再配平离心，加入生理盐水后血液管总重应大于用于配平的生理盐水管，配平时仅需向生理盐水管中加生理盐水，避免血液管溶血。离心机运转期间需有人看守，避免异常出现，使用完毕后，将设置时间和转速均调至最小，关闭开关，切断电源，并整理电线。

2.3 红细胞悬液配制方法

最后一次离心结束后吸出上清液时可在红细胞泥上方留0.5 cm高度的生理盐水用于压实红细胞泥，吸取红细胞泥时用将量程0.1～1 mL的微量移液器调至150 μL，采用反向移液吸取150 μL红细胞泥，分多次均匀打入已准备好的14.85 mL生理盐水中，烧杯底贴试验台轻轻摇匀，配制好15 mL 1%鸡红细胞悬液。1%鸡红细胞悬液制备的优劣很大程度决定了试验进度和结果。

3 血凝(HA)试验

血凝试验做3重复。移液器采用正向移液的方式垂直将样品加在96孔V型血凝反应板底部。标准抗原倍比稀释时用移液器第一档在液面下混匀后排空吸头，再重新吸取一定体积液体放至下一孔。每行抗原倍比稀释后需更换枪头。为避免各孔间相互污染，生理盐水和1%鸡红细胞悬液应由后往前悬滴加入。为保证每孔加入液体浓度一致，标准抗原在吸取前充分混匀，1%鸡红细胞悬液边摇边加。试验结果应在12孔空白对照红细胞呈明显钮扣状沉于V型板孔底时及时判定。

4 配制四单位病毒

4HAU(Hemagglutinating Unit，四单位病毒)是标准抗原和生理盐水按比例配制而来，赛项规定配制10～20 mL 4HAU，以配制12.8 mL 4HAU为例，配制比例如表3。

表3 4HAU配制比例

配制4HAU时先用移液器吸取生理盐水至50 mL小烧杯内，再吸取标准抗原，反复吹洗多次，充分混匀到生理盐水内。4HAU浓度的准确性用回滴实验校正，2021年鸡新城疫抗体水平测定赛项参照GB/T16550—2008，未要求回滴实验，但2020年开始实施的GB/T16550—2020明确给出了4HAU的检测方法。

5 血凝抑制(HI)实验

为确保每孔的加样量和浓度一致，4HAU和1%鸡红细胞悬液由后往前边摇匀边悬滴加入，血清使用前用移液器吹打混匀，倍比稀释时在同一位置垂直缓慢吹打3～5次，避免产生气泡。加完4HAU后，用微型震荡器震荡15 s，感作30 min。加完1%红细胞悬液震荡后，试验结果应在12孔空白对照红细胞呈明显钮扣状沉于V型板孔底，且阴阳性对照成立时及时判定。等待血凝抑制试验结果时可将仪器和器皿复位，将生理盐水配平管中的生理盐水倒入液废缸，生理盐水离心管、采血器、剩余的红细胞泥离心管等均放入固废缸，保证实验场地整洁。

6 抗体滴度报告

报告单主要包含：血凝试验的血凝价，血凝抑制试验4HAU的稀释度和待检血清的抗体滴度，用log2表示血凝价和抗体滴度，若抗体效价为10log2，应写为≥10log2。清晰填写抗体滴度报告，不乱涂乱改。

7 结果分析

以2021年鸡新城疫抗体水平测定赛项规程为例，结果分析占实验总成绩的5%，这是2018年赛项规程所没有的。结果分析包含三部分内容：血凝抑制试验阳性(≥4log2)；个体免疫合格(≥5log2)；群体免疫合格率(个体免疫合格数目/样品总数)≥70%则群体免疫合格，无需补免；群体免疫合格率<70%则群体免疫不合格，需要补免。若样本取自免疫鸡群，造成这种结果的原因有两方面，其一，若免后时间小于两周，很大的可能是在抗体水平没上去的时候感染了野毒，需要隔离并紧急接种。其二，若免后时间大于两周，很有可能是免疫失败，需选择合适的时间采取补免；若样本取自非免疫鸡群，需隔离消毒，用四倍量的四系弱毒苗紧急免疫。

“以赛促教、以赛促学”的教学理念促进高等职业教育教学模式的不断深化改革。在教师层面，改变了教师传统的教学观念，增强了教师理论与实践深度融合的能力。在学生层面，提升了学生的专业实践能力、职业素养和处理实际生产问题的能力。与此同时，备赛过程促进各高等职业院校畜牧兽医类专业的深层交流，为课程改革乃至专业建设带来新视角、新方向。