维生素类物质在猪精液常温保存中的应用研究进展

李雨晴，胡冰艳，庞卫军

(西北农林科技大学动物科技学院，陕西省动物遗传育种与繁殖重点实验室，陕西 杨凌 712100)

目前，人工授精技术在大多数生猪生产国中的应用高达90%以上，是应用最广泛、最有效的生猪繁殖生物技术。猪人工授精技术以种猪培育和商品猪生产为目的，提高了生产繁育的安全性，降低在自由交配过程中的疾病传播，从而提高养猪业的经济效益，是科学养猪、实现养猪生产现代化的重要手段。由于猪的精液保存是实施人工授精的重要环节，且公猪的精液品质直接决定着母猪的受胎率和产仔数，因此在生产实践中对种公猪的精液质量要求更高。然而猪精液在常温保存下容易受到温度、渗透压、pH、微生物和活性氧等影响，导致精子活性和受精能力下降。此外，公猪精子细胞膜中多不饱和脂肪酸(PUFAs)的含量较高，对脂质过氧化特别敏感，极易受到氧化损伤。

近年研究发现，维生素B12、C和E等物质因其较强的抗氧化特性，可以有效降低精液中氧化物的浓度，减少精子在储存过程中对氧化应激的影响，从而提高精子质量。维生素类物质，是人和动物生长所必需的少量有机化合物，目前因具有较强的抗氧化活性而备受关注。Vamawskij等发现在绵羊精液稀释液中添加维生素E有利于提高冷冻后精子的活力，人们开始意识到维生素在精液保存中的重要作用。研究表明，在精液稀释液中加入适当的维生素类物质能够增加精子顶体完整率，有效减缓活性氧(ROS)过量积累对精子细胞造成的损伤。

本文主要就维生素类物质在猪精液常温保存中的应用进行综述，以期为猪精液常温保存稀释剂的改进和人工授精技术的发展应用提供科学参考。

1 猪精液常温保存技术概述

随着人工授精技术在生猪养殖业的广泛应用，精液保存的研究也成为了各方关注的焦点。目前精液保存方法有3种：(1)在15～25 ℃下进行的常温保存；(2)在0～4 ℃下进行的低温保存；(3)在-196℃环境下进行的冷冻保存。由于猪精子细胞膜的胆固醇/磷脂较低，精子对低温的耐受能力较差，且经过冷冻保存后的精子活力不易恢复、受精能力和受孕率都低，所以我国大多数规模化猪场在进行人工授精时选择常温保存的精液。公猪精液一般保存在16～18 ℃的环境中，此温度降低了精子新陈代谢和能量消耗，使精子处于一个可逆性的静止状态，当温度回升至37 ℃时，又可以恢复正常的活力和代谢水平，精子受精能力不会受到太大的影响。且常温保存技术对设备、生产成本要求低和人员操作简单。因此，与其他方法相比，常温保存精液是在生产实践中进行猪人工授精的首要选择。

然而常温保存的精液同样存在一定问题，比如精子寿命有限，在体外只能保存7 d左右，但保存有效期一般仅为2～3 d；随着保存时间延长，精子活力明显下降, 严重影响猪的受精率、受胎率和胚胎早期死亡等。据报道，猪精液体外保存的时效与ROS自由基的累积密切相关，如超氧阴离子、羟基自由基和H2O2等。ROS可通过诱导脂质过氧化、损伤DNA和蛋白质以及耗尽ATP等直接损伤精子，导致精细胞凋亡和死亡，还可以破坏精子的酶防御系统，使其无法忍受在精液保存过程中遇到的氧化攻击，间接地对精子产生氧化损伤。总之，ROS可以通过多种途径对精子造成不同程度的损伤，进而影响精液品质。猪精子质膜中PUFAs含量高，对脂质过氧化的敏感性也高于其他物种，更易受到氧化应激伤害。因此需要在猪精液稀释剂中添加适当的抗氧化物质以缓解不利因素对精子造成的毒害作用，提高常温保存的精液品质。

2 维生素类物质在猪精液常温保存中的应用

在猪常温精液保存中常用的抗氧化剂有酶类抗氧化剂，比如超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和过氧化氢酶(CAT)等；非酶类抗氧化剂，比如氨基酸及多肽类、维生素类、生物类黄酮和类胡萝卜素等。研究发现，维生素作为一类抗氧化物质，可以有效降低溶液中氧化物的浓度。目前维生素B12、C和E在猪精液常温保存中的研究较多，但其他维生素类化合物如D-异抗坏血酸钠、维生素P、番茄红素和烟酸等在一定程度上也会影响精液质量。

2.1 维生素B12

维生素B12，又称钴胺素，主要存在肉类、鱼和奶制品中，是目前人体内唯一含金属的维生素。据研究，维生素B12具有抗氧化性，可保护DNA免受自由基的损伤，同时作为一种生物活性物质，可以改善体外精子周围环境，提升精子活力和生存率等。研究表明，在稀释液中添加海藻糖和维生素B12可以使保存3 d的精子成活率仍保持在70%左右。2018年马红发现，在民猪的精液常温保存中添加45 mmol/L维生素B12处理组的精子成活率和质膜完整性显著高于空白对照组，表明补充维生素B12对精子活力、精子发生和维持正常精子功能都至关重要。据报道，维生素B12的缺乏或过量对精子内DNA的合成会造成严重影响，致使功能下降，在动物实验中也证实了缺乏维生素B12可阻滞精子发生。综上，维生素B12可以通过提高精子活力、维持精子发生和保护质膜完整性等作用，改善猪常温保存中精子的质量。此外，维生素B12的浓度含量也会在一定程度上影响保存效果，因此在实际生产中要严格控制维生素的浓度，以免对精子产生不利影响。

2.2 维生素C

维生素C，是一种多羟基化合物，广泛存在新鲜蔬菜和水果中，因具有酸的性质，又被称为抗坏血酸。维生素C是血浆中主要的水溶性抗氧化剂，具有高效的自由基清除能力，可以防止精子DNA的氧化损伤、减少脂质过氧化、中和H2O2和O2-的不利影响和有效提高精子的成活率和顶体的完整度等功能。研究发现，在民猪精液常温稀释液中添加30 mmol/L维生素C可以显著提高民猪精子质膜完整性、精子成活率等指标。在大白公猪常温精液保存剂中添加维生素C，对常温保存6 d后精子的相关抗氧化酶和凋亡情况进行检测发现，稀释剂中添加维生素C组的总抗氧化能力(T-AOC)、还原型谷胱甘肽(GSH)、SOD和CAT活性均显著高于对照组，表明维生素C可以减少精子细胞凋亡的数量，提高精子抗氧化能力。据研究，在大白公猪常温精液稀释剂中添加0.068 g/L维生素C可以提高猪精子活率、质膜完整性率和顶体完整率。此外，任子利等在改进猪精液稀释液中添加5.0 g/L维生素C可以明显改善藏猪精液在4 ℃条件下保存的效果，显著提高精子活率、顶体完整性和质膜完整性，并且可以明显降低4 ℃保存对藏猪精子畸形率和精子全基因组DNA甲基化的影响。可见，维生素C在猪精液液体保存技术中发挥重要作用(表1)，在维持和保护精子抗氧化功能的同时，也可能作为一种抗菌抑菌物质以调节精子细胞免疫功能，降低精子保存过程中因多种因素造成的损伤。

表1 维生素C在猪精液液体保存技术中的应用

2.3 维生素E

维生素E，又名α-生育酚，作为人和动物机体一种必需的营养素，具有保护机体组织结构、增强机体免疫力、抗菌、抗氧化和抗应激等多方面的生物学功能。近年研究发现，维生素E作为亲脂性抗氧化剂，带有过氧化氢自由基清除基团，通过与脂质过氧化链中产生的脂质自由基反应来保护精子膜不被氧化，维持精细胞膜的稳定性；还能抑制精子中自由基的形成，提高精子顶体完整率及降低精子的畸形率。Cerolini等在猪精液稀释液中添加维生素E能防止常温保存5 d的精液中不饱和脂肪酸22：6 n-3的氧化还原，提高精子活力。研究表明，在精液中添加200 μmol/L维生素E可以有效降低在15 ℃条件下储存72 h的公猪精液中丙二醛(MDA)含量。研究发现，添加200 μmol/L维生素E有助于猪精液常温保存中精子的质膜完整，使精液中的ROS维持在较低水平。据研究，在常温保存精液中添加25 mmol/L维生素E的精子成活率和质膜完整性显著高于对照组，而且保存5 d的精子仍可在生产中使用。此外，在公猪常温保存精液稀释粉中添加适量的维生素E可以减缓精子顶体畸形率的发生, 增加顶体完整率，有效减缓外界对精子的伤害作用。除抗氧化作用外，维生素E可以通过减少凋亡基因的表达来抑制ROS的生成，说明维生素E添加至精液保存液中可能会提高精细胞的免疫活性。然而公猪若缺乏维生素E会导致精子活力降低、数量减少和质量低下等。总之，维生素E在猪常温精液保存中发挥重要作用(表2)，具有提高精子活力、增加顶体完整率、降低精子畸形率、减少MAD和ROS含量等多样性功能，可有效提升猪精液储存过程中的精子品质，有利于人工授精技术的广泛推广应用。此外，维生素E含量也会在一定程度上影响保存效果，因此在实际生产中要严格控制维生素的添加量，以免对精子产生不利影响。

表2 维生素E在猪精液常温保存技术中的应用

2.4 其他

D-异抗坏血酸钠(表3)，又名异抗坏血酸钠、赤藻糖酸钠和异维生素C钠，是一种新型生物助色剂，因抗氧化、无毒副作用，广泛用于肉类、鱼类、蔬菜和罐头等食品中防腐保鲜助色。D-异抗坏血酸钠是一种水溶性抗氧化剂，它的分子结构易于脱氢，容易与ROS发生反应。研究发现，在猪常温保存的基础精液中添加0.006 mg/mL D-异抗坏血酸钠时效果最好，能够有效提升精子活率、精液总抗氧化能力和保护质膜完整性等指标，同时可降低ROS水平。表明D-异抗坏血酸钠在猪精液常温保存中可以全面综合改善精液质量。

维生素P(表3)，又称芦丁、路通和芸香甙等，为黄酮类化合物，来源于芸香叶、烟叶、橙皮和荞麦花等，是清除自由基的强氧化剂，具有增强机体对传染性疾病的抵抗力及协同其他类维生素共同发挥抗氧化等作用。刘亚伟等发现在猪三种精液稀释液中添加维生素P对精子具有保护作用，可以明显延长猪精子常温保存的时间，显著提高精子的活力、成活率和顶体完整性等相关指标，但是维生素P的最佳适宜添加浓度并不一样，可能是由于三种稀释液种类及成分的影响。目前对于维生素P在精液保存中的研究还比较少，未来将会是一个重要研究方向。

番茄红素(表3)，又称茄红素，具有抗氧化、抑制脂质过氧化和降低核酸损伤等多种重要功效。研究表明，番茄红素是维生素类化合物中有效的抗氧化剂，有极强的抗氧化性和自由基清除能力，它去除单线态氧(1O2)的能力是β-胡萝卜素的2倍、维生素E的100倍。猪冷冻稀释液中添加一定浓度的番茄红素，可以显著提高解冻后的精子质量，且当添加浓度为2.0 μmol/L时，猪精子活率、线粒体活性、质膜完整性和顶体完整性较好。因此，番茄红素作为一种安全无毒的天然抗氧化剂，未来可以考虑添加到猪精液常温保存稀释剂中研究其抗氧化效果。烟酸(表3)，又称尼克酸，是维生素B3的衍生物，是人体中不可缺少的营养成分，具有抗氧化、保护细胞膜、稳定自由基和活性氧等功能。研究证明，烟酸不仅能提高野猪精子在常温保存中的存活率和顶体完整性，也能提升冷冻解冻后精子的生存能力和线粒体活性，同时可以抑制顶体反应，进而改善精子质量。Lee等发现烟酸可以提高冻融猪精子质膜完整性，增加PUFAs含量，抑制脂质过氧化反应。综上，由于精子对温度相对敏感，低温或冷冻保存下的精子活力会受到抑制，烟酸可以减轻猪精液在储存过程中产生的氧化应激，通过抑制顶体反应和脂质过氧化反应等途径，提升精液品质。

表3 其他类维生素在猪精液保存技术中的应用

3 总结与展望

猪精液保存作为人工授精中的关键步骤，对提高生猪繁殖性能具有重要意义。维生素类物质作为抗氧化剂在精液保存中的研究具有广阔的应用前景，尤其对于提高人工授精的精子受精率也有非常重要意义。目前维生素类物质在猪精液保存中的应用存在以下问题，并提出相应的建议。

3.1 改变维生素理化性质

维生素物质本身稳定性差，且部分脂溶性维生素具有高度亲脂性，水溶解度低，很难将营养成分混合到以水为基础的精液稀释剂中。未来可基于新型纳米技术的制备以产生纳米活性分子，从而改变维生素的溶解度、溶解速率、表面积和稳定性等理化性质。

3.2 研发生产复合维生素

现多数集中于研究单个维生素对猪精液保存的影响，但某单一维生素已不能有效发挥抗氧化作用。因此在实际生产中可通过多次科学配比实验，将两种或两种以上维生素同时添加至精液稀释剂中，可能更有利于延长精液体外保存时间。此外，研发生产复合维生素能有效降低养猪成本，促进养猪业更好发展。

3.3 探究维生素类物质对精子保护作用机制

已证明维生素作为一种抗氧化剂可以显著改善精液质量，但其对于精子保护作用机制并不是十分清楚。在未来研究中，可将分子生物技术和精子品质分析技术联合起来探究作用机理，更进一步探索维生素类物质对精子的分子调控机制，这也是未来重要研究方向。