基于网络药理学探讨玉屏风散治疗肝细胞癌的作用机制

金 虹 庞雪莹 刘松江

(1 黑龙江中医药大学，哈尔滨，150040； 2 黑龙江中医药大学附属第一医院，哈尔滨，150040)

肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma，HCC)为全球第6大常见癌症，约占原发性肝癌的80%，目前已是我国第4位的常见恶性肿瘤及第3位的肿瘤致死病因[1]，给患者带来了巨大的生理及心理双重压力，同时加重了社会的经济压力。肝癌在中医学上可归属于积聚、癥瘕、臌胀范畴。《中藏经》曾言道：“积聚癥瘕杂虫者，皆五脏六腑真气失而邪气并。”HCC的发病原因多因正气不足所致，气虚无以行血，最终导致肝血因瘀而不通，长期可致肝体失于濡养，造成气滞血瘀于内，故而形成癥瘕积聚，终发为肝癌[2]。在临床中由于早期诊断方法不足且HCC发病隐匿，导致多数患者在最终临床确诊时已属于中晚期，丧失手术机会，现临床实践提示经导管动脉栓塞化疗(Transcatheter Arterial Chemoembolization，TACE)可有效延长患者生存期，但术后仍常出现疼痛、发热、恶心等一系列不良反应[3]。

现代研究表明中药在临床上可整体调节机体状态，具有疗效可观且不良反应小的特点，可通过多通路、多靶点等角度治疗疾病[4]，故HCC的临床诊疗模式正逐渐向中西医结合治疗转变。正气不足为中医学总结得出的HCC发病的主要原因，玉屏风散作为中医学中扶正固表的经典名方，不但可增强机体免疫力[5]，还可调节机体产生抗肿瘤的作用[6]。方中所涉及的黄芪、防风、白术均为临床治疗HCC中的常用药[7]。现代研究表明，黄芪不但具有抗肿瘤作用，还具有调节机体免疫功能和抗氧化等作用[8]，白术具有促进肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖、提高对肿瘤细胞的细胞毒性和抑制肿瘤组织的侵袭能力等作用[9]，防风在研究中表明其具有抗炎，抗氧化及抗肿瘤等作用[10]。因此可推测玉屏风散存在治疗HCC的潜在作用靶点及机制。

采用网络药理学研究方法可从系统层面揭示中药对机体调控的作用，所构建的“药物-成分-疾病”的靶点网络图作为一种新的研究思路，突破了单一靶点，单一途径的药物研究束缚，其独有的系统性、整体性与中医药研究的理念契合[11-12]。本文借助网络药理学的研究手段，探讨了玉屏风散治疗HCC的作用机制，为今后使用玉屏风散治疗HCC的临床及实验研究提供了新的探索思路及方向。

1 资料与方法

1.1 获取与筛选玉屏风散的活性成分 将玉屏风散中所含药物，即黄芪、防风及白术在中药系统药理学数据库与分析平台(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP)(http://tcmspw.com.php)中进行检索。将筛选标准设置为口服生物利用度(Oral Bioavailability，OB)≥30%，类药性(Drug Likeness，DL)≥0.18，筛选出有效成分后，将玉屏风散活性成分的靶基因通过TCMSP进行预测，使用UniProt数据库(https://www.uniprot.org/)将获得的靶点进行基因标准化处理，去除重复值。

1.2 获取疾病靶点 以“Hepatocellular Carcinoma”作为关键词在GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中进行搜索，将检索到的蛋白通过UniProt数据库进行基因标准化处理。

1.3 构建“药物-疾病-成分-靶点”网络图 筛选玉屏风散活性成分的靶基因与疾病基因的共同基因，绘制韦恩图并导入Cytoscape 3.7.2软件中以形成“药物-疾病-成分-靶点”的网络图，其中的节点(Node)代表了药物的活性成分、关键靶基因及HCC等，边(Edge)则代表点与点的作用关系。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用网络的构建 使用STRING数据库(http://string-db.org)，将选项中的物种定义为“Homo sapiens”，以构建玉屏风散治疗HCC核心靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络，再将以上所得数据导入至Cytoscape 3.7.2中，利用“Network Analyze”从而进行网络拓扑的参数分析，并设置Degree值大于平均值(≥11)作为标准以进行筛选，最终得到核心靶点信息。

1.5 基因本体富集分析及京都基因和基因组百科全书富集分析 使用DAVID(https://david.ncifcrf.gov/)数据库将筛选出的PPI网络核心靶点进行导入，将种属选项定义为“Homo Sapiens”，再依次选取“GOTERM_BP_DIRECT”“GOTERM_CC_DIRECT”“GOTERM_MF_DIRECT”和“KEGG_PATHWAY”进行基因本体(Gene Ontology，GO)生物过程的富集分析和京都基因和基因组百科全书富集分析(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富集分析，设置筛选标准为P≤0.05，得到符合条件的前10条生物过程和KEGG通路，并用条形图进行结果展示。

2 结果

2.1 筛选及预测药物活性成分靶点 最终得到玉屏风散的活性成分对应靶点共92个，其中有效成分包括细胞肿瘤抗原p53(Cellular Tumor Antigen p53)、凋亡调节剂Bcl-2(Apoptosis Regulator Bcl-2)、血管内皮生长因子受体2(Vascular Endothelial Growth Factor Receptor 2)、白细胞介素-6(Interleukin-6)等。见表1。

表1 玉屏风散主要成分

续表1 玉屏风散主要成分

2.2 玉屏风散治疗HCC的潜在作用靶点 药物与疾病的韦恩图得到交集靶点，即玉屏风散治疗HCC的潜在靶点，共66个。见图1。

图1 药物-疾病韦恩图

2.3 “药物-疾病-成分-靶点”网络拓扑图分析 构建的“药物-疾病-成分-靶点”网络图中，红色代表疾病及药物，橙色、黄色、紫色分别代防风、黄芪、白术中有效成分所对应的节点，共51个，蓝色代表玉屏风散有效成分及HCC所对应靶点，其平均自由度为10.38。见图2。

图2 “药物-疾病-成分-靶点”网络

2.4 筛选出核心靶点 构建的玉屏风散与HCC共同靶点的PPI网络图包括65个节点，328条边。筛选出26个的核心靶点，即IL-6、TP53、TNF、NOS3、ESR1、JUN、PTGS2等。见图3～4。

图3 玉屏风散与HCC的共同靶点PPI网络

图4 玉屏风散治疗HCC的核心靶点

2.5 GO富集分析结果 最终得到146个条目，各取前10个条目形成富集条形图，其中主要涉及到RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、MAPK级联反应的正调控及类固醇激素受体活性等。见图5。

图5 GO功能富集分析

2.6 KEGG通路富集分析 KEGG通路富集分析共得到54个条目，取前10个制作富集条形图，其中涉及癌症信号通路、TNF信号通路及胰岛素抵抗等通路。见图6。

图6 KEGG功能富集分析

3 讨论

HCC虽有临床治疗措施，但5年生存率仍然较低[13]，中医学认为HCC的发病机制主要归结为正虚邪实，正虚以脾气虚及肝肾不足为主，邪实则以气滞血瘀为主，治疗时应兼顾标本。在临床中中药可作用于疾病的各个发展环节，可整体调动机体的免疫功能，已有研究表明玉屏风在治疗HCC的过程中具有增强抗肿瘤以及调节机体免疫力的功效[14-16]。方中以黄芪为君，在内可补脾肺，在外可固表，以白术为臣可益气健脾，以上二药相须为用，既可顾护卫表，又可令外邪难侵，另用防风为佐，既可祛风又可御风，三药合用可顾护正气且不留邪。方中黄芪为扶正固本之良药，现代研究表明，其主要成分为黄芪多糖，不仅可以直接起到免疫调节及抗病的作用，还可以通过改善微生态从而起到间接的免疫调节作用[17]。防风的主要成分为原酮类及香豆素2类，其具有抗炎、抗惊厥、抗肿瘤及镇痛等作用[18]。白术中含有苯丙烷、黄酮、固醇、苯醌和多糖等成分，具有善肠胃功能、抗氧化、抗肿瘤和保护肝脏等作用[19]。

本研究运用网络数据挖掘的技术将玉屏风进行网络药理学分析，并筛选其有效成分与HCC的交集靶点，制作形成“药物-疾病-成分-靶点”网络拓扑图，将关键靶点进行了生物通路的富集分析，结果表明玉屏风散治疗HCC可能与IL-6、TP53、TNF、NOS3、ESR1、JUN、PTGS2等靶点有关。IL-6为一种细胞因子，其具有诱导B细胞分化，提高自然杀伤细胞活性，诱导急性期的反应并可刺激肝细胞，抑制细胞凋亡等作用。肿瘤坏死因子则是一种与炎症反应相关的细胞因子[20]。肿瘤蛋白p53(Tumor Protein p53，TP53)作为一种抑癌蛋白，可以起到诱导细胞周期阻滞、凋亡及衰老的作用，也可参与DNA的修复或代谢改变[21]。一氧化氮合酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)为一种异构酶，其中NOS3主要作用为增加血管通透性及调节血管扩张度[22]。前列腺素内过氧化物合酶(Prostaglandin-endoperoxide Synthase，PTGS)2为PTGS诱导型，其参与了HCC的病情进展全过程，其在肝癌组织表达阳性并在进展期肝癌组织中高表达，与血管内皮生长因子正相关，其特异性抑制剂可抑制肝癌细胞增殖并诱导细胞凋亡[23]。促癌蛋白c-Jun氨基端蛋白激酶可以通过结合转录启动区域的方式调控相关蛋白表达，构成促癌信号环路[24]。根据网络途中结果显示可知β-谷甾醇、黄芩素、原酮类、甜菜碱、异紫花前胡内酯、5-O-甲基维斯阿米醇、珊瑚菜素所涉及共有靶点最多，这些成分可能参与了玉屏风散治疗HCC的过程。另外本研究还通过GO富集分析及KEGG生物通路富集分析中看出，使用玉屏风散治疗HCC的主要靶点涉及细胞核、与RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、促分裂原活化的蛋白激酶(Mitogenactivated Protein Kinase，MAPK)级联反应的正调控、类固醇激素受体活性以及TNF信号通路等，其中与细胞核相关的靶点最多。

综上所述，玉屏风散治疗HCC具有多通路、多靶点、多成分的特点，本研究对可能涉及的机制进行了分析研究，为玉屏风散治疗HCC提供了新思路。但网络药理学分析的结果仅提示玉屏风散与HCC的相关性，且受限于数据库的完整性，故而仍需要后续深入研究以进一步考察。