基于全基因组测序及平均核苷酸一致性分析鉴定1株哥伦比亚分枝杆菌*

蔡兴龙，耿林玉，纪玥玥，贾佳，高硕，周万青(南京大学医学院附属鼓楼医院 . 检验科，. 风湿免疫科，南京 210008)

哥伦比亚分枝杆菌(Mycobacteriumcolombiense)属非结核分枝杆菌(nontuberculous mycobacteria，NTM)，为缓慢生长分枝杆菌，是鸟分枝杆菌复合群(M.aviumcomplex，MAC)中新发现的一个种[1]。该菌可致免疫缺陷患者或免疫功能正常患者淋巴结炎和皮肤播散性感染[2]。通过常规的细菌培养、生化反应甚至质谱技术，很难对分枝杆菌进行准确鉴定，尤其是一些新发现的菌种，常需借助分子生物学技术实现菌种水平鉴定。本研究报道1例哥伦比亚分枝杆菌致系统性红斑狼疮(SLE)患者体表感染案例，通过全基因组测序(whole-genome sequencing，WGS)技术结合平均核苷酸一致性(average nucleotide identity，ANI)分析实现菌种鉴定。

1 材料与方法

1.1患者资料及菌株来源 患者女，52岁，因“间断发热，全身乏力，右膝破溃流脓加重两月余”于2021年11月18日收住南京大学医学院附属鼓楼医院风湿免疫科。患者既往于2009年诊断为系统性红斑狼疮、硬皮病和类风湿关节炎。入院查体：双手关节变形，右手食指末端缺如，右腕关节肿胀，表面可见1 cm×2 cm大小包块，皮温稍高，触之有波动感；右膝关节上下可见数处皮肤缺损，周围红肿，表面渗液，右膝关节外侧可见一大小约3 cm×4 cm缺损，中间呈黑色结痂，渗液较多，有臭味；右侧小腿有2 cm×1 cm破溃，右侧大腿内侧1 cm×1.5 cm破溃。实验室检查：WBC 2.90×109/L，Neu 94.8%，CD3+CD4+细胞22×106/L，B淋巴细胞7×106/L，C反应蛋白112.10 mg/L，降钙素原(PCT)0.81 ng/mL，白细胞介素-6(IL-6)70.21 pg/mL，血糖6.69 mmol/L，糖化血红蛋白7.6%，结核T细胞γ干扰素阴性，G试验9.40 pg/mL，GM试验0.10，巨细胞病毒DNA<500 IU/mL，EB病毒DNA 2.27×104IU/mL。分泌物行革兰染色、抗酸染色及培养，抗酸染色阳性，培养获得菌株经WGS结合ANI分析鉴定为哥伦比亚分枝杆菌。右膝破溃处清创，碘伏消毒后高锰酸钾湿敷，隔日换药。异烟肼(0.6 g，qd)+利福平(0.45 g，tid)+阿奇霉素(0.5 g，qd)+乙胺丁醇(0.75 g，qd)+莫西沙星(0.4 g，qd)抗感染治疗。12月13日，患者右膝关节数处破溃均无渗出及脓液，疼痛稍好转，后应家属要求办理出院。

1.2主要仪器及试剂 CO2培养箱、哥伦比亚血琼脂平板(Thermo scientific公司)；Vitek MS微生物质谱检测系统及配套试剂(法国生物梅里埃公司)；革兰染色液、抗酸染色液(珠海贝索公司)；磁珠法细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物公司)；Illumina HiSeq 2000高通量测序系统(美国Illumina公司)。

1.3细菌培养 患者于11月18日和12月7日先后2次采集分泌物，右膝破溃处常规消毒处理破溃处后，用无菌拭子取深部分泌物送检；分泌物标本接种哥伦比亚血琼脂平板置35 ℃、5%CO2培养箱培养，同时进行涂片制备、革兰染色与抗酸染色。

1.4质谱鉴定 采用Vitek MS(V3.2)进行鉴定。将培养菌落刮取并涂布在靶板上，滴加0.5 μL甲酸，干燥后滴加1 μL基质液后行质谱鉴定。

1.5WGS及ANI分析 采用磁珠法提取细菌总DNA，参照试剂说明书操作。委托上海生工生物公司使用Illumina HiSeq 2000测序系统进行WGS。提取核酸经琼脂糖凝胶电泳及浓度检测合格后进入文库构建，对样本DNA进行双向测序(paired-end，PE)构建450 bp文库；对测序结果进行质量剪切后，用SPAdes v3.13.0软件(https://www.patricbrc.org/app/Assembly2)将序列进行拼接，以得到最优化组装结果。采用RAST tool kit(RASTtk)(https://www.patricbrc.org/app/Annotation)进行基因组注释。采用ResFinder-4.1 Sever检索耐药基因携带情况(https://cge.food.dtu.dk/services/ResFinder/)。采用OrthoANI方法(https://www.ezbiocloud.net/tools/ani)进行菌种鉴定[3]。

2 结果

2.1培养及涂片结果 11月18日采集患者腿部分泌物样本直接涂片行革兰染色，可见大量革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌；抗酸染色见抗酸杆菌：3条/300个视野；经培养分离鉴定出金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌。12月7日送检分泌物直接涂片抗酸染色阳性，革兰染色未见明确菌体；接种哥伦比亚血琼脂平板培养至7 d可见无色粗糙扁平小菌落生长(编号MC230)(图1)，培养物涂片抗酸染色呈阳性(图2)，革兰染色不易着色；麦康凯平板不生长，巧克力平板生长。

图1 哥伦比亚分枝杆菌血平板菌落形态(培养7 d)

图2 菌落涂片抗酸染色(×1 000)

2.2质谱鉴定 纯菌落经质谱鉴定，未获得鉴定结果。

2.3WGS、组装和ANI分析 MC230基因组大小为5 671 138 bp，GC含量为67.93%，总基因数为5 399个，64条Contigs，N50：307 543 bp，N75：213 155 bp；47个tRNA，5S rRNA、16S rRNA和23S rRNA各1个；全基因组序列提交至NCBI数据库，GenBank号为JALPSB000000000。经ResFinder-4.1 Sever检索分枝杆菌耐药相关基因结果显示，MC230基因组存在链霉素耐药相关基因rrsg.462C>T。将MC230菌株全基因组序列进行ANI分析，结果显示与哥伦比亚分枝杆菌模式菌株CECT 3035的OrthoANI值为98.05%。

3 讨论

哥伦比亚分枝杆菌最早于2006年由Murcia等[4]在哥伦比亚波哥大4名艾滋病患者的血液和痰标本中分离并报道，为缓慢生长型。后续研究发现该菌广泛分布于水环境和土壤中，并作为机会性感染病原菌累及患者淋巴结、肺部、皮肤、骨髓等部位[5]。本例患者患有多种自身免疫病及糖尿病，有糖皮质激素、多种免疫抑制剂和广谱抗生素使用史，上述均是感染NTM的高危因素。该患者右下肢出现多处相似的浅表性溃疡，分泌物标本直接涂片抗酸染色阳性，推测可能发生了体表接触性感染或者血流播散性感染。由于感染的经久性，难免会混合细菌性感染。本患者首次采样涂片可见抗酸染色菌体，但培养时因大量铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的生长很难搜寻分枝杆菌的菌落。在外科清创及消毒处理后再次采样，去除细菌的干扰，并目标性延长培养时间，终获哥伦比亚分枝杆菌菌落。目前，尚无关于哥伦比亚分枝杆菌的推荐用药，只能参考MAC的用药指南，经验性联合使用克拉霉素、乙胺丁醇、利福平、异烟肼和阿奇霉素[6-7]。在1例儿童哥伦比亚分枝杆菌引起的皮肤感染患者治疗过程中，使用克拉霉素0.5 g/d，利福平0.75 g/d，莫西沙星0.3 g/d，持续3个月，获得很好改善[2]，与本病例使用方案相仿。

分枝杆菌的鉴定手段包括涂片抗酸染色、蛋白质谱鉴定及分子鉴定。本例患者临床标本直接涂片抗酸染色呈阳性，提示存在分枝杆菌感染。后续首先采用质谱技术进行菌种鉴定，但未获得鉴定结果。经核实，现使用的质谱数据库缺乏哥伦比亚分枝杆菌鉴定谱，可见数据库的完备性影响NTM的准确鉴定[8]。当然，正确的菌落预处理，包括破壁处理环节，也是获得准确鉴定的前提。依靠16S rRNA基因序列分析在分枝杆菌的菌种鉴别上有时无法获得确切种的信息，时常需增补rpoB或hsp65基因。基于hsp65基因多态性分析、rpoB基因分析、DNA杂交和分枝杆菌细胞壁成分高效液相色谱法分析均有助于哥伦比亚分枝杆菌与其他MAC相鉴别[5,9]。而基于WGS结合ANI分析可获得DNA杂交相似的菌种鉴定能力[10-11]。本研究对该分离菌株进行基因组测序发现，其基因大小、GC含量及所编码蛋白基因数量等均与已报道哥伦比亚分枝杆菌相似[12]。基于ANI分析，发现其与哥伦比亚模式菌株CECT 3035的OrthoANI值为98.05%，高于94%阈值[3]，由此可将MC230菌株鉴定为哥伦比亚分枝杆菌。在免疫抑制剂使用、免疫功能低下或艾滋病人群中遇到浅表皮肤难治性感染时，需考虑NTM和结核分枝杆菌的感染可能。对于NTM的实验室诊断，可采取临床标本直接涂片抗酸染色获得快速病原方向，而确切的菌种信息仍需经培养后的蛋白分析或分子生物学手段获得。